相差顯微鏡，即相位對(duì)比顯微鏡（Phase Contrast Microscope）、相襯顯微鏡，是基于相襯顯微技術(shù)原理（Phase Contrast Microscopy, PCM）開發(fā)的可將樣品透射光相位信息轉(zhuǎn)換為光振幅變化以提高透明樣品圖像對(duì)比度的一種光學(xué)顯微鏡。

       荷蘭物理學(xué)家Frits Zernike（弗里茨·澤爾尼克，1953年物理學(xué)諾獎(jiǎng)獲得者）在20世紀(jì)30年代發(fā)明的相襯顯微技術(shù)，將倒置相差顯微鏡與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)緊緊地聯(lián)系在一起。人們無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行染色處理便可直接觀察活細(xì)胞形態(tài)特征、分裂和增殖的活動(dòng)過(guò)程。相差顯微技術(shù)誕生后，配套環(huán)形光闌、相襯物鏡等光學(xué)元件的研究改進(jìn)隨之展開，推動(dòng)了倒置相差顯微鏡的廣泛應(yīng)用，極大地促進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展，具有劃時(shí)代的意義。

       半個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，透射光相差分析被視為活細(xì)胞觀察的基礎(chǔ)和經(jīng)典方法。相應(yīng)地，透射光相差觀察功能不僅是Zeiss Primovert、Leica DMiL、Nikon ECLIPSE TS2、舜宇I(lǐng)CX41、Motic AE2000這類基礎(chǔ)型手動(dòng)倒置相差顯微鏡的立命之本，相差觀察模式也是Axiovert 5 Digital、Leica Mateo FL、Invitrogen EVOS FLoid數(shù)字式倒置熒光顯微鏡，Zeiss Axio Observer 7、Leica DMi8與Olympus IXplore Pro（IX83）等具有多路光源輸入接口和圖像出口的研究級(jí)多功能電動(dòng)倒置熒光顯微鏡，BZ-X810、Invitrogen EVOS F70000、APX10等新型一體式熒光顯微成像系統(tǒng)的基本功能選項(xiàng)。不僅如此，以高通量成像、3D細(xì)胞圖像渲染和多維度高內(nèi)涵圖像分析為核心任務(wù)的寬場(chǎng)式高內(nèi)涵、共聚焦式高內(nèi)涵分析系統(tǒng)，如ImageXpress Micro Confocal、ImageXpress Confocal HT.ai、Operetta CLS與Opera Phenix Plus，也可視實(shí)驗(yàn)需要選配相差成像模塊，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞相差、熒光相結(jié)合的多模式圖像疊加處理與分析。                                              

       倒置相差顯微鏡的功能設(shè)計(jì)和光路結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，既是新型相差技術(shù)引入應(yīng)用的先導(dǎo)平臺(tái)，同時(shí)也成為我們觀察活細(xì)胞相差觀察技術(shù)改良演變的微視場(chǎng)。而回顧經(jīng)典相襯顯微技術(shù)原理和實(shí)施要素，有助于更好地理解、探討當(dāng)前相襯技術(shù)方法上創(chuàng)新嘗試及其理論淵源。

一、相差顯微技術(shù)的基本構(gòu)成要素

       光波在穿過(guò)非真空介質(zhì)時(shí)會(huì)產(chǎn)生振幅（即強(qiáng)度）和相位的變化。振幅變化通常是由于介質(zhì)對(duì)光的吸收，變化程度與波長(zhǎng)（光的顏色）有關(guān)。

       人眼或光電傳感器能感知的是光波振幅和顏色的變化。物理學(xué)上將引起光波振幅變化的樣本或結(jié)構(gòu)稱為振幅體（amplitude objects）。染色的標(biāo)本等振幅體內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)和區(qū)域光密度不一，光透射率不同，則透射光會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)度和顏色的差異，從而為人眼所感知。

       而培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、原生動(dòng)物、細(xì)菌、精子的尾等細(xì)胞或結(jié)構(gòu)完全透明。入射光與透射光間的強(qiáng)度變化微弱。此情況下采集的圖像上，細(xì)胞與培養(yǎng)基、細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器間，明暗反差過(guò)小，難以清晰、完整地表征細(xì)胞的外形和內(nèi)部細(xì)節(jié)特征。

       然而，無(wú)論樣品是否完全透明, 因內(nèi)部構(gòu)造、組成成份、密度和折射率的不均衡，造成入射光的衍射、折射等傳播路徑改變和光程的不同。而光程變化使光波相位的不一致，既光產(chǎn)生了相移（phase shift）。這類在光線穿過(guò)時(shí)引起相移的標(biāo)本或結(jié)構(gòu)稱為相位體（phase object)。相位體與透射光相互作用造成的光相位差異，為光波干涉的發(fā)生提供了基礎(chǔ)條件。

       光若毫無(wú)遮攔地前行穿透相位體薄層，則最終以接近直射的方式從樣品中射出。這部分光統(tǒng)稱為直射光（Direct light、surround light）或參考背景光。如光線在穿越樣品層中遇到樣品中細(xì)微差異性結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞膜、細(xì)胞器等）干擾，發(fā)生衍射和散射，則統(tǒng)稱為衍射光（Diffracted light）。顯然，衍射光攜帶有與樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)差異有關(guān)的光相位信息。

       相襯顯微技術(shù)是根據(jù)惠更斯—菲涅耳原理，將非均一結(jié)構(gòu)與屬性相位體透射光中天然的衍射光和直射光分別提取，對(duì)光波振幅和(或)相位進(jìn)行必要調(diào)制處理后重新復(fù)合，利用光干涉原理將光波的相位差異以光的明暗方式予以呈現(xiàn)。同時(shí)，利用相位與復(fù)合光波振幅二者的線性關(guān)系，將光波相干疊加形成的明暗分布與樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性聯(lián)系起來(lái)而創(chuàng)建圖像分析方法。這種基于透射光相位調(diào)制的成像方法稱為相襯對(duì)比法或相差法(Phase Contrast)。該技術(shù)是涵蓋從指導(dǎo)理論到實(shí)施方法的一套完整體系。它無(wú)需染色處理即可將透明樣品在鏡下展現(xiàn)出反差足夠、錯(cuò)落有致的明暗分布，實(shí)現(xiàn)相位體內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息的可視化。

       F. Zernike的相差顯微技術(shù)的相差顯微技術(shù)的核心要素主要包括以下三個(gè)方面。

1、環(huán)形光闌（Annular diaphragm）

       環(huán)狀光闌是安裝于聚光器上透射光源與聚光鏡之間的聚光鏡轉(zhuǎn)盤（Condenser Disk）或相襯滑塊（Phase Slider or Light-Ring Slide）中圓盤狀照明調(diào)節(jié)元件。照明光線從盤面的透明圓環(huán)區(qū)射入后，聚光鏡將圓環(huán)形照明光焦聚投射到樣本上形成一實(shí)心光斑。與暗視野（Dark-Field, DF）觀察法的相同之處在于：照明光的大部分被環(huán)形光闌阻擋，僅允許透明圓環(huán)區(qū)的少量光線以小角度斜射在樣品上。不同點(diǎn)是相襯法需保留照明光源并用作參考光。照明光大致沿原入射方向（忽略在樣品薄層中光傳播方向因折射造成的輕微平移）穿透樣品直達(dá)物鏡，并被重新校正為平行光束抵達(dá)物鏡相位板的共軛區(qū)。一小部分照明光線與樣品中光學(xué)致密結(jié)構(gòu)（例如質(zhì)膜、細(xì)胞器等）相遇而發(fā)生衍射，產(chǎn)生約1/4λ的相移。

2、相位板（annular phase plate）

       相位板為相差物鏡專屬，固定安裝在物鏡后焦平面上，是相襯觀察的核心光學(xué)元件。

       F. Zernike的研究發(fā)現(xiàn)：將樣品衍射光與穿透樣品未發(fā)生衍射的參考光（直射光）相結(jié)合并發(fā)生相干作用方可觀察到樣品透射光振幅的差異；將參考光波相位提前1/4λ，使參考光與衍射光之間的的相位差增加至1/2λ時(shí)，產(chǎn)生相消干涉，可實(shí)現(xiàn)相干疊加波幅的最大化，相位體圖像的對(duì)比度最優(yōu)；因直射光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于衍射光的強(qiáng)度，須將直射光強(qiáng)度削弱到接近于衍射光的強(qiáng)度后，才會(huì)觀察到顯著明暗反差對(duì)比。

       直射光的相位調(diào)制和光強(qiáng)度削減，被視為相襯顯微技術(shù)所的兩個(gè)基本規(guī)則。而相位板正是據(jù)此原理設(shè)計(jì)的。

       相位板為圓盤式，采用了2個(gè)無(wú)色補(bǔ)償區(qū)（Complementary Area）夾1個(gè)深色環(huán)狀共扼區(qū)(Conjugate Area)的同心圓布局。

       共扼區(qū)：又稱相位環(huán)(Phase Ring)，為相位板上與環(huán)狀光闌對(duì)應(yīng)的深色圓環(huán)。表面鍍有光吸收薄膜（故外觀看顏色較深），可吸收大部分參考光，使參考光波振幅衰減至與衍射光振幅相當(dāng)。此外，共軛區(qū)還鍍有相位膜，使參考光通過(guò)時(shí)相位提前1/4λ（共軛環(huán)區(qū)厚度薄于補(bǔ)償區(qū)）或延遲3/4λ（共軛環(huán)區(qū)厚度厚于補(bǔ)償區(qū)）。使得衍射光與參考光之間相位差達(dá)1/2λ而發(fā)生相消干涉，增強(qiáng)光波相干疊加振幅和相襯對(duì)比效果。

       補(bǔ)償區(qū)：相位板盤面共扼面之外的無(wú)色透明區(qū)域，用于透射來(lái)自樣品的衍射光。衍射光傳播方向呈360°發(fā)散狀態(tài)，為盡量多地收集衍射光以增強(qiáng)疊加波幅，故盤面的大部分面積都用作補(bǔ)償區(qū)。表面鍍膜易造成衍射光的損失，多數(shù)相位板為補(bǔ)償區(qū)無(wú)深色吸光介質(zhì)設(shè)計(jì)，外觀光潔透明。

(待續(xù)：3、環(huán)形光闌-相位板共軛)