使用倒置顯微鏡在相差成像模式下對(duì)未染色活細(xì)胞的觀察與圖像采集是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的基本操作。

        倒置顯微鏡的透射光照明光源(transmitted-light illumination或dia-illumination)，不管是配置LED冷光源的Olympus CKX53、Leica DMi1、DM IL LED，還是配備鹵素?zé)粽彰鞯柠溈藠W迪AE2000倒置相差顯微鏡，透射光路上光源與聚光鏡之間設(shè)有濾光片架（Filter Slot, Filter Holder或Filter magazine），用于安裝透射光濾光片（transmitted light filter）。不同機(jī)型適用的濾光片直徑大小、可容納濾光片數(shù)量不等。此外，不同個(gè)案隨機(jī)提供的濾鏡功能類(lèi)型和數(shù)量有別。而論文發(fā)表編審環(huán)節(jié)對(duì)細(xì)胞圖片質(zhì)量并無(wú)特定要求。因此，在實(shí)際細(xì)胞成像操作中，透射光濾光片的運(yùn)用容易被忽視。

        雖然透射濾光片售價(jià)不過(guò)區(qū)區(qū)數(shù)百元，對(duì)顯微鏡整體造價(jià)的影響甚微，但確是倒置相差顯微鏡系統(tǒng)配置時(shí)須慎重斟酌的可選元件。此外，明場(chǎng)、相差、DIC和霍夫曼浮雕相襯觀察模式下對(duì)光路中光學(xué)元件檢查調(diào)整操作，常視作顯微鏡成像設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)步驟載入廠商操作指南。

        本文嘗試對(duì)細(xì)胞明場(chǎng)成像常用的透射光濾光片作一總結(jié)，以饗讀者。

一、倒置顯微鏡常用透射光路濾光片的功能類(lèi)型

1.1 中性密度濾光片（Neutral Density Filter, ND）

        中性密度濾光片，也叫灰色濾光片（Grey filter）、中灰濾鏡、中性衰減片等，簡(jiǎn)稱ND鏡。它采用特殊吸光材料制成，對(duì)波長(zhǎng)400～700nm范圍的可見(jiàn)光亮度具有均衡、中性無(wú)差別的衰減作用，而對(duì)入射光色溫（color temperature）影響小，故稱為中性密度濾光片。

        光密度（Optical density, OD）常用來(lái)代表光通過(guò)透明介質(zhì)時(shí)的衰減程度（介質(zhì)的對(duì)光的吸收程度）。入射光強(qiáng)度一定時(shí)，介質(zhì)吸收光強(qiáng)度大，則透射光強(qiáng)度小。用透光率（T%）來(lái)表示光線透過(guò)介質(zhì)的能力。

        根據(jù)鏡片材料OD值的不同，不同光密度ND鏡用“N+數(shù)字”的方式標(biāo)示其，N后面數(shù)字代表鏡片OD值。透光率(T%)與OD值間的換算關(guān)系為T(mén)%=100/N。

        以N16濾鏡為例，它代表穿透鏡片的透射光強(qiáng)度減少到入射光強(qiáng)度的100/16 = 6.25%。

        培養(yǎng)細(xì)胞圖像采集中使用的光吸收式ND鏡常用規(guī)格有：

        ND2：透光率50%（透射光亮度減至入射光之1/2）；

        ND4：透光率25%（透射光亮度減至入射光之1/4）；

        ND8：透光率12.5%（透射光亮度減至入射光之1/8）；

        ND16：透光率6.3%（透射光亮度減至入射光之1/16）。

        ND后面的數(shù)字越大，減光能力越強(qiáng)，同等曝光設(shè)置條件下所采集的圖像越暗。如要提高鏡下視場(chǎng)亮度，應(yīng)選用N后數(shù)值較小的ND鏡。不同光密度類(lèi)型的ND鏡既可以單獨(dú)使用，也可以多片ND鏡組合使用，使得對(duì)視場(chǎng)照明亮度的調(diào)控精細(xì)化。

        在細(xì)胞相差觀察中，當(dāng)照明光源的亮度、視場(chǎng)光闌（Field diaphragm）、聚光鏡頭的孔徑光闌（Aperture diaphragm）保持一致，則同一視野樣品的透射光強(qiáng)度在用不同放大倍率物鏡觀察時(shí)是不變的。從低倍鏡切換到高倍鏡觀察時(shí)，高倍物鏡數(shù)值孔徑（Numerical Aperture, NA）大于，故高倍物鏡的光通量大，獲得的圖像更亮。

        雖然調(diào)節(jié)光源的亮度固然可調(diào)整視野明暗，但光源亮度調(diào)整的同時(shí)，往往容易造成光源色溫變化。這一點(diǎn)在鹵素?zé)敉干涔庠粗斜憩F(xiàn)得尤為明顯。

        而調(diào)整聚光鏡孔徑光闌也能減少視場(chǎng)通光量，但圖像細(xì)微結(jié)構(gòu)分辨能力會(huì)因此而受損。

        此時(shí)，將數(shù)字較高的ND鏡轉(zhuǎn)入光路來(lái)降低視場(chǎng)亮度，可替代對(duì)顯微鏡照明亮度控制按鈕的調(diào)節(jié)，有利于維持不同倍率物鏡下圖像亮度趨于穩(wěn)定、圖像反差對(duì)比，保持圖像拍攝條件和圖像質(zhì)量的可再現(xiàn)性。

        用ND濾鏡調(diào)整透射照明光亮度，操作簡(jiǎn)便且便于統(tǒng)一，又不影響光源色溫及圖像分辨率，因此是細(xì)胞倒置成像操作中亮度調(diào)節(jié)的首選方案。蔡司Axio Observer 7、Axiovert 5、Primovert 顯微鏡的Grey filter 0.25與Grey filter 0.06，Olympus CKX53、Olympus IXplore Standard（IX73）及Olympus IXplore Pro （IX83）顯微鏡的45-ND6、45-ND25都屬于ND濾鏡。

1.2 色溫轉(zhuǎn)換濾光片（Colour Temperature Conversion Filter）

        色溫即光源的顏色。用于衡量光源色彩的尺度是基于19世紀(jì)末英國(guó)物理學(xué)家開(kāi)爾文勛爵（Lord Kelvin）的“黑體”（black body）熱力學(xué)-光轉(zhuǎn)換理論建立的?！昂隗w”受熱后會(huì)呈現(xiàn)不同顏色。隨著溫度由低到高，“黑體”依次向外輻射黑-紅-黃-白-藍(lán)的可見(jiàn)光。按這一原理，任何可見(jiàn)光的顏色皆可對(duì)應(yīng)于“黑體”在某個(gè)溫度輻射光的顏色。藍(lán)光對(duì)應(yīng)于“黑體”高溫，而紅光與“黑體”較低溫度相對(duì)應(yīng)。因此，可用熱黑體輻射相同顏色可見(jiàn)光時(shí)的熱力溫度值來(lái)代表光源的色溫。色溫的計(jì)量單位為開(kāi)爾文(Kelvin, K)。例如，暖白色白熾燈光色溫約為2700K，普通日光燈光色溫約為6000K，而正午陽(yáng)光的色溫約5000K。

部分倒置顯微鏡型號(hào)透射光源色溫

        倒置相差顯微鏡數(shù)碼相機(jī)所采集的透射光顏色是透射光源、培養(yǎng)基和細(xì)胞綜合作用形成的。不同實(shí)驗(yàn)室、不同批次樣品所獲得的細(xì)胞相差圖像色溫差別很大。暖色調(diào)透射光環(huán)境下細(xì)胞圖像色調(diào)整體偏黃，而冷色調(diào)透射光下采集的圖像偏藍(lán)。

        既要確保用于發(fā)表的細(xì)胞圖像資料真實(shí)準(zhǔn)確和可重復(fù)性，又要改善細(xì)胞圖像的對(duì)比度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)的有效呈現(xiàn)，提高發(fā)表圖片質(zhì)量，利用色溫轉(zhuǎn)換濾光片對(duì)細(xì)胞樣品透射光源進(jìn)行色溫調(diào)整是細(xì)胞圖像采集過(guò)程中行之有效的常規(guī)操作方法。

        用色溫校正濾光片調(diào)整光源色溫遵守的是光色互補(bǔ)原理：采用對(duì)紅色和綠色通道增強(qiáng)，對(duì)藍(lán)光減弱提高圖像黃色占比，達(dá)到暖色效果；反之，增強(qiáng)光源中的藍(lán)光或同時(shí)減少紅綠光，即可降低色溫。

        用于調(diào)整光源的色溫濾光片有降色溫濾光片、升色溫濾光片兩大類(lèi)。降低光源色溫的濾光片為琥珀色（橙色）系濾光片。升色溫濾光片為藍(lán)色系濾光片。隨濾光片顏色深淺程度不同，對(duì)光源色溫降低幅度有所不同：顏色深，降色溫作用明顯；顏色淺降色溫效應(yīng)小。

Leica DM IL LED倒置熒光顯微鏡可選色溫轉(zhuǎn)換濾鏡表

        蔡司Axio Observer 7、Axiovert 5倒置熒光顯微鏡的Conversion filter（5700–3200K, d=32 mm）色溫轉(zhuǎn)換濾光片用于將5700K色溫的LED光源轉(zhuǎn)換為色溫3200K鹵素?zé)艄狻?/span>

1.3 對(duì)比度增強(qiáng)濾鏡（Contrast enhancement）

        對(duì)比度是指一幅圖像最明亮區(qū)域和最陰暗區(qū)域間亮度層級(jí)的差別程度，即圖像中亮和暗之間灰度反差的大小。

        較低的對(duì)比度，圖像明暗區(qū)域間的過(guò)渡平滑柔和，明暗區(qū)帶間界限模糊，圖像整體缺乏層次感。高對(duì)比度圖像中的亮度差異強(qiáng)烈，明暗區(qū)域的界限清晰，目標(biāo)輪廓突出，出立體層次感明顯。但容易造成細(xì)節(jié)損失、高光區(qū)域過(guò)度曝光產(chǎn)生光暈或局部區(qū)域曝光不足，圖像質(zhì)量下降。

        采用閾值設(shè)定、邊緣檢測(cè)和形態(tài)學(xué)檢測(cè)細(xì)胞的方法用于細(xì)胞圖像自動(dòng)化分析中，細(xì)胞分割是基礎(chǔ)。細(xì)胞相差圖像中，只有分析對(duì)象與背景有足夠的對(duì)比度，分析軟件才可以在圖像中識(shí)別和檢測(cè)到分析目標(biāo)。若細(xì)胞圖像中細(xì)胞與背景的灰度級(jí)有較強(qiáng)重疊，差異極小。一般的閾值類(lèi)方法難以從背景中分割出細(xì)胞，影響圖像分析中細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞融合度等檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

        倒置相差顯微鏡增強(qiáng)圖像對(duì)比度的方法是引入圖像對(duì)比度增強(qiáng)濾光片。

        對(duì)比度濾光片，又稱反差濾鏡，是黑白攝影（如未染色細(xì)胞相差圖像采集）中改變被攝景物的色調(diào)以提高對(duì)比的濾光鏡。其運(yùn)用方法為：提高光源中某種色彩的比例，使該色光線增強(qiáng)，在圖像中的灰度值上升，色澤變淺（變白）；相反，如要降低色彩灰度值，使之在圖像中色澤加深（變暗），則采用對(duì)該色光有吸收濾過(guò)作用的濾光片，削弱該色彩的光線。要使某色種色彩在圖像上的色調(diào)變淺時(shí)（信號(hào)降低，圖像灰度值降低），用允許該色光通過(guò)的濾光片；反之，若要使某種色彩在圖像上的色調(diào)加深，則使用可濾除該色光的濾光片。有多種長(zhǎng)通、短通、帶通濾光片可用于色彩增強(qiáng)，提高圖像對(duì)比度。譬如，黃色濾光片可濾除藍(lán)、紫色，允許黃色光及紅、橙、綠色光通過(guò)。藍(lán)色濾光片濾除紅橙黃綠色，允許波長(zhǎng)較短的藍(lán)光通過(guò)。

        倒置顯微鏡下的細(xì)胞相差圖像是基于穿透細(xì)胞的直射光與細(xì)胞衍射光間干涉原理形成的。常用的對(duì)比濾光片是綠色干涉濾光片(Green interference filter , GIF) 。這種濾光片能有效地過(guò)濾掉照明光源中的紅、橙、藍(lán)、紫色，運(yùn)行綠色和黃光通過(guò)，可以有效地增強(qiáng)光源中黃綠色光，削弱藍(lán)光，提高LED照明光源的色溫，提高圖像黑白對(duì)比度。透射光源以藍(lán)綠光為主，相差干涉圖像銳利，細(xì)胞的細(xì)節(jié)特征呈現(xiàn)更清晰，故特別適適合無(wú)標(biāo)活細(xì)胞的觀察及拍照。Leica DMi1倒置相差顯微鏡的Green filter （11526125），Olympus CKX53/IXplore Standard/ IXplore Pro 的550nm Green Interference Filter（43IF550W45）皆屬于對(duì)比度增強(qiáng)型濾光片。

        此外，黃綠色濾光片、黃色濾光片具有增強(qiáng)培養(yǎng)細(xì)胞圖像對(duì)比度的功能。Leica DMi1 Yellow filter（11526126）就屬于這一功能類(lèi)型。

二、其它倒置顯微鏡透射光照明濾光片

2.1 照明漫射濾光片（Frost Diffusion Filter）

        顯微鏡視場(chǎng)照明光分布不均，造成的細(xì)胞相差圖像亮度不均衡，會(huì)對(duì)圖像分析過(guò)程中細(xì)胞的識(shí)別、粘連細(xì)胞的分割、形態(tài)學(xué)檢測(cè)和細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)產(chǎn)生干擾。

        漫射濾光片由內(nèi)含光散射物質(zhì)的玻璃制成，其透射光比毛玻璃更均勻，可為樣品提供更均勻、柔照明效果。Olympus IXplore Standard（IX73）、IXplore Pro（IX83）顯微鏡的45mm Frosted Diffusion Filter等即屬于此類(lèi)用途的濾光片。

2.2 白平衡（White Balance）調(diào)整濾鏡

        不同細(xì)胞、培養(yǎng)基和照明光源條件下，數(shù)碼相機(jī)采集的培養(yǎng)細(xì)胞透射光圖像，獲得的圖像色溫存在區(qū)別。LED光源視場(chǎng)下獲得的圖像色調(diào)偏藍(lán)，而鹵素照明燈光下拍攝的圖像偏黃。對(duì)在特定光源下拍攝時(shí)圖像偏色現(xiàn)象，可通過(guò)加強(qiáng)光源的互補(bǔ)色（如紅色與藍(lán)色）來(lái)修正。將在不同環(huán)境色溫中白色物體調(diào)整成人眼視覺(jué)習(xí)慣的白色，叫做白平衡調(diào)整。如LED白光照明光源白色偏藍(lán)，那么白平衡調(diào)整方法就是減弱藍(lán)、同時(shí)增加綠和紅光比例，使所成圖像呈現(xiàn)為白色。

        白平衡濾光片特別適合染色細(xì)胞和組織切片的觀察和成像。Olympus IXplore Standard（IX73）、IXplore Pro（IX83）顯微鏡提供的Light Balancing Daylight Filter（45-LBD-IF）即屬白平衡濾鏡。

2.3 吸熱濾光片

        可吸紅外波長(zhǎng)光線的玻璃濾光片，可減低照明光中的熱輻射對(duì)標(biāo)本的影響。

參考文獻(xiàn)

[1] 機(jī)標(biāo)JB/T 8226.5－1999—《光學(xué)詢價(jià)件薄膜·中性濾光膜》

[2] 張勇喜, 金秀, 楊文華, 等. 中性密度濾光片中性程度評(píng)價(jià)方法[J]. 光學(xué)儀器, 2013, 35(5): 85–89.

[3] Leica DMi8 Instructions for Use, Revision 1.1

[4] Leica DM IL Instructions

[5] Olympus IX73生物顯微鏡使用說(shuō)明書(shū)

[6] Olympus CKX53光學(xué)顯微鏡使用說(shuō)明書(shū)

[7] 吳京城，施露露，杜亞南等. 基于雙重高斯濾波的細(xì)胞圖像快速分割方法[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2022, 59 (2): 0210002, 網(wǎng)絡(luò)出版