微需氧菌（microaerophilic bacterium）是指能在3% - 15% (v/v) 氧氣含量環(huán)境下生長、在20-21%氧含量大氣及無氧環(huán)境中生長受抑制細菌的統(tǒng)稱。除了空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni ）、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,HP）等報道較多的人體致病菌外，還包括腸道中微需氧型雙歧桿菌，淡水、海洋硫化物等沉積物及廢水生物膜中硫酸鹽還原細菌（Sulfate-Reducing Bacterial, SRB），Zetaproteobacteria代表的近岸海洋沉積物、海底熱液環(huán)境中的嗜中性微需氧鐵氧化菌（FeOB）及從溫泉中分離的微需氧菌等多種寄生菌。

       微需氧菌常在含5%-O₂,10%-CO₂和85%-N₂的氣體環(huán)境、28- 42℃溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)方法有玻璃缸蠟燭培養(yǎng)法、氣囊培養(yǎng)法、厭氧罐培養(yǎng)法（Anaerobic Jar）、三氣培養(yǎng)箱法（multigas incubator）和微需氧工作站（Microaerobic Workstations）培養(yǎng)法等。

燭缸培養(yǎng)法和氣囊培養(yǎng)法難以穩(wěn)定維持的氣體含量。

       厭氧罐培養(yǎng)系統(tǒng)由氣瓶、氣體控制單元和培養(yǎng)罐組成，具有充排氣的氣體置換、氧氣（1%-15%)和CO₂（5%-15%）濃度的自動控制功能，可提供穩(wěn)定低氧培養(yǎng)環(huán)境。系統(tǒng)無法調(diào)控培養(yǎng)罐工作溫度，故須將培養(yǎng)罐置于恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱或霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

       三氣培養(yǎng)箱(multigas incubator)具備常規(guī)微需氧菌培養(yǎng)所需的O₂（1% - 18%）、CO₂（0% - 20%）、溫度（RT+5℃ - +50℃）及濕度控制條件，但缺少樣品準備環(huán)節(jié)低氧操作環(huán)境。

       微需氧工作站集O₂、CO₂及溫濕度自動控制功能于一體，既是天然的低氧培養(yǎng)箱，又兼樣品制備的低氧環(huán)境操作臺，為微需氧菌實驗樣品制備、接種培養(yǎng)和檢測分析全流程的解決方案。既可置于普通實驗桌面工作，也可訂制專用工作臺架連同氣瓶、真空泵等輔助裝置安裝于實驗室一角運行使用。

       厭氧工作站和微需氧工作站兩者的整體結(jié)構(gòu)基本一致，故有廠商將二者合稱厭氧/低氧工作站，寓意可一機兩用。事實上，二者的治氧目標、技術(shù)途徑、硬件配置及支持氣體均存在明顯區(qū)別。本文基于工作站的氣體環(huán)境調(diào)控機制來探討微需氧工作站軟硬件、配套氣體需求的特殊性，以便讀者在工作站的使用與選擇上胸有成竹。

一、微需氧工作站的艙內(nèi)環(huán)境調(diào)控機制

       微需氧工作站的一個核心功能是將工作艙內(nèi)空氣中氧分壓從20.9%降至5-6%的水平并長期維持穩(wěn)定。在運行前，工作艙內(nèi)充填的是空氣。

       若將空氣理想化為由O₂-21%、N₂-78.1%及1%其它氣體組成，無NO₂、H₂S、甲醛等有毒成份及塵埃污染的標準混合氣體。則無需將艙內(nèi)氣體抽出一半后，僅輸入CO₂、N₂，即可使艙內(nèi)氣體環(huán)境達到設(shè)定目標。

       但因地域、環(huán)境、氣候及天氣等條件影響，加之空氣中的塵埃及硫化氫、揮發(fā)性有機物（VOC）、NO₂等有毒氣體污染的存在，為確保最終氣體環(huán)境一致性，標準流程應是先真空排出工作艙內(nèi)空氣，再按氣體組成比例（如85%-N2：10%-CO₂：5%-O₂）輸入高純度工作氣體來完成氣體置換。

       在有氧呼吸鏈傳遞系統(tǒng)中，質(zhì)子和電子的最終受體是O₂。菌體從環(huán)境中攝取1mol O₂可產(chǎn)生2mol水蒸氣。微需氧菌一方面攝入CO₂，另一方面在有氧呼吸過程中消耗O₂并排放代謝產(chǎn)物CO₂和水蒸氣。微需氧菌攝取CO₂的動機仍不十分清楚，但作為非固碳菌，理論上，培養(yǎng)過程中的排碳應高于固碳。最終結(jié)果是：工作艙內(nèi)O₂消耗低于CO₂和水蒸氣的盡增長，氣體總量上升。

       微需氧菌通常需在含高濃度（5%-10%）CO₂的氣體環(huán)境下培養(yǎng)。而系統(tǒng)根據(jù)O₂、CO₂傳感器檢測結(jié)果和控制算法，自動輸入相應流量的O₂、N₂，將O₂、CO₂的氣體分壓恢復至設(shè)定水平。通過自動泄壓裝置釋放部分氣體，可保持艙內(nèi)氣壓的正常。無論是工作氣流輸入、艙內(nèi)氣壓維持，全部由系統(tǒng)自動控制，無需人工干預。

       高純度的輸入氣體易造成培養(yǎng)基風干脫水。數(shù)字化濕度控制單元可控制直熱式水汽蒸汽發(fā)生器或艙外水汽霧化裝置，將艙內(nèi)環(huán)境濕度維持在70% R.H.的默認值或更高（85-95% R.H.）設(shè)定水平。當艙內(nèi)濕度超過設(shè)定值，系統(tǒng)則啟動除濕機制，風扇驅(qū)動艙內(nèi)氣體循環(huán)，在流經(jīng)半導體制冷控制冷凝器時，將水汽快速冷凝幫你改收集到艙外集水瓶中，從而降低艙內(nèi)濕度。

       微需氧菌培養(yǎng)環(huán)境溫度通常高于20℃-26℃的室溫。系統(tǒng)通過升溫加熱和柜體自動對外輻射散熱的控溫機制，將艙內(nèi)溫度（RT+5℃-+65℃）維持穩(wěn)定。

       可見，在氣壓與溫濕度這幾個工作環(huán)境參數(shù)調(diào)控、真空泵運用方面，微需氧工作站與厭氧工作站基本一致。二工作艙內(nèi)氣體環(huán)境調(diào)控的具體對象和調(diào)控機制，則存在根本區(qū)別。這就給微需氧工作站在配套體、硬件配置和系統(tǒng)控制層面都提出了不同要求。

二、微需氧工作站運行配套氣體需求

       微需氧工作站艙要精確控制工作艙段O₂、CO₂兩種氣體的組成比例并保持穩(wěn)定，必然要從外部引入O₂和N₂氣體。在已知CO₂和水蒸氣分子總量盡增長背景下，為維持5%-O₂、10%-CO₂和85%-N₂這一比例，O₂輸入量必高于實際消耗量，同時補充N₂。

       假設(shè)某個培養(yǎng)階段，工作艙內(nèi)消耗了2體積的O₂、新增1體積的CO₂排放。則系統(tǒng)需輸入輸入2.69體積O₂外加10.1體積N₂，或直接補充12.81體積的壓縮空氣中（O₂組成比例約21%），將艙內(nèi)O₂、CO₂比例恢復。可見，用單一壓縮空氣替代相對昂貴的N₂、O₂兩種純凈氣體用作艙內(nèi)兩種氣體的補充來源方案，是經(jīng)濟而可行的。

       工作站的操作過程保留了N₂吹掃環(huán)節(jié)，以防外部空氣經(jīng)樣品轉(zhuǎn)移艙、袖套窗口與艙內(nèi)氣體對流而破壞艙內(nèi)O₂穩(wěn)態(tài)。因此，標準微需氧工作模式下，工作站運行所需配套氣體為三種，即N₂（轉(zhuǎn)移艙及操作袖套的N2吹掃）、CO₂（在初始階段提供10%濃度的CO₂）和壓縮空氣（正常工作狀態(tài)下艙內(nèi)O₂含量的維持）。這與厭氧工作站的N₂+AMG、三氣培養(yǎng)箱的N2、CO₂雙氣源供氣模式都不同。

       包括幽門螺桿菌和空腸梭菌在內(nèi)，超過200種病原菌攜帶有氫化酶基因。氫化酶（hydrogenases）的作用在物種、不同菌株間存在差異。氫化酶不僅在微生物呼吸鏈中攝入的H₂裂解成電子和質(zhì)子，質(zhì)子氧化產(chǎn)能產(chǎn)生PMF。一些腸道菌群還借助于氫化酶發(fā)酵產(chǎn)升H₂，并在腸道組織中擴散和飽和。幽門螺桿菌呼吸鏈中PMF產(chǎn)生具有結(jié)腸微生物群產(chǎn)H₂依賴性。鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲桿菌、簡易彎曲桿菌和幽門螺桿菌（包括致癌菌株）等幾種病原體，利用宿主結(jié)腸組織中分子氫為呼吸基質(zhì)（respiratory substrate），對其生長和毒力表現(xiàn)至關(guān)重要。實驗證實，在培養(yǎng)氣體中添加H₂，幽門螺桿菌菌體數(shù)量在16小時內(nèi)實現(xiàn)40% - 60%的增長，且10小時內(nèi)從[¹⁴C]碳酸氫鹽積累的碳增加了3倍。H₂使得幽門螺桿菌在胃腸道定植（colonization）中保持關(guān)鍵的競爭優(yōu)勢。

       微需氧菌培養(yǎng)中是否需引入H2問題，目前學界并無一致意見。但空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌的培養(yǎng)氣體中添加H2的應用（(5%-O₂, 2%-H₂, 88%-N₂, 5%-CO₂）早有報道。從目前公開報道看，多數(shù)微需氧菌實驗用的是三氣培養(yǎng)模式。

       加H2的辦法是在微需氧培養(yǎng)三組氣體基礎(chǔ)上增加一路H_2-N₂混合氣源。這樣，H2、N₂、CO₂和空氣構(gòu)成了微需氧工作站的四氣工作模式。

三、微需氧工作站的硬件配套要求

       厭氧工作站無論配置厭氧指示劑定性或氧氣傳感器定量監(jiān)測，均可滿足O₂含量控制在安全界限以下的調(diào)控要求。

       微需氧工作站在三氣模式下，要實時定量檢測O₂、CO₂兩種氣體含量，并根據(jù)傳感器讀數(shù)，自動調(diào)整壓縮空氣的輸入量，確保O₂含量維持在設(shè)定值。而四氣工作模式下，則須在三氣應用配置基礎(chǔ)上增加H₂傳感器及配套氣路控制單元。

       如采用肉眼觀察氧氣指示劑或氧氣傳感器讀數(shù)，人工計算、手工控制各種氣體的輸入量，容易出現(xiàn)操作失誤，以致艙內(nèi)氧氣含量偏離設(shè)定范圍，危及樣品安全。多個參數(shù)手工控制方式，極大增加操作負擔，對操作者個人的經(jīng)驗和操作熟練程度要求極高，不適用于大多數(shù)的實驗者。因此，微需氧工作站一般采用觸摸屏操作設(shè)置工作，系統(tǒng)通過PLC核心控制器，根據(jù)實驗設(shè)置集中對多環(huán)節(jié)、多參數(shù)自動化調(diào)控管理。市面上，DWS H35、江雪AG300 plus、Mini Station Plus、E500、E500G、QD500、E600，龍躍LAI-3T-N20、LAI-3DT等數(shù)字化自動控制的機型，是可以用作微需氧培養(yǎng)基礎(chǔ)架構(gòu)的。

       微需氧氣體環(huán)境穩(wěn)定須依托對多種工作氣體流量的精確控制。采用三氣運行模式的DWS H35、H25低氧工作站，設(shè)有N₂、CO₂和壓縮空氣三個獨立氣路接口，每個氣路的流量、啟閉都由系統(tǒng)獨立控制。而DWS M35微需氧工作站是標準四氣工作模式，內(nèi)部氣路結(jié)構(gòu)與控制模塊更為復雜。

       國產(chǎn)微需氧（低氧）工作站，一般基于標準厭氧工作站雙氣工作氣路結(jié)構(gòu)（一個N₂、一個AMG氣體）設(shè)計，標準配置下無法直接管控3-4種工作配套氣體。構(gòu)建微需氧環(huán)境，須引入獨立外置氣體混合器模塊。氣路具體接入方法是：N₂瓶與機身N₂專用輸入接口直接連接；CO₂、空氣及H₂需與氣體混合器上相應氣體輸入接口連接，通過混合器輸出端口，與工作站的AMG輸入口對接。氣體混合器根據(jù)設(shè)置參數(shù)，可在多種氣體間切換和根據(jù)指令選擇性開放、關(guān)閉所需的氣體控制閥。

       當然，系統(tǒng)軟件首先得有CO₂、空氣、H₂參數(shù)控制界面入口。DWS H35低氧工作站操作界面無H₂設(shè)置功能，可用于三氣模式下的微需氧環(huán)境控制，但不適用于四氣工作模式。

四、小結(jié)

       微需氧工作站集實驗樣品準備操作和培養(yǎng)于一體，有效彌補常規(guī)缸蠟燭培養(yǎng)、氣囊培養(yǎng)、厭氧罐培養(yǎng)及三氣培養(yǎng)箱的缺少樣品操作空間上的不足。工作艙內(nèi)O₂、CO₂、H₂、溫度、濕度等工作參數(shù)全自動、實時精確控制，是實現(xiàn)微需氧菌、微需氧寄生蟲（如藍賈第鞭毛蟲、陰道毛滴蟲等）、哺乳動物細胞低氧培養(yǎng)應用的標準化實驗工具。

       由于工作艙內(nèi)氣體調(diào)控對象、目標方法的差異，微需氧工作站從系統(tǒng)控制軟件、艙內(nèi)氣體傳感器配置種類、工作氣體的輸入與控制單元，與厭氧工作站的應用配置均顯著不同。一般說來，通過簡單的氣瓶更換，微需氧工作站可以秒變?yōu)閰捬豕ぷ髡荆坏珔捬豕ぷ髡疽獙崿F(xiàn)到微需氧工作站的絢麗轉(zhuǎn)身，單靠靠邁出切換氣瓶這一步還遠遠不夠。

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