讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-1

      《光密度值和灰度值如何在Western Blot條帶定量和凝膠圖像分析中應(yīng)用？》提到了灰度值在圖像中的涵義和在Western Blot條帶蛋白定量分析中的適用問(wèn)題。

       本文采用美國(guó)伯樂(lè)公司公開(kāi)發(fā)表實(shí)驗(yàn)資料Bulletin，基于圖像灰度值分析法，按ImageJ 1.46R操作指南，對(duì)實(shí)驗(yàn)圖像進(jìn)行分析回溯，用從圖像分析取得的數(shù)據(jù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，重構(gòu)各檢測(cè)條帶蛋白含量對(duì)比關(guān)系。通過(guò)與公開(kāi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)曲線間的對(duì)比，評(píng)估圖像分析數(shù)據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)資料披露數(shù)據(jù)的再現(xiàn)、還原程度，探究圖像灰度值數(shù)據(jù)用于Western Blot條帶定量分析的操作流程、方法創(chuàng)建過(guò)程，同時(shí)檢驗(yàn)該分析方法在蛋白免疫印跡檢測(cè)分析中應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1.1 圖像來(lái)源及基礎(chǔ)工作準(zhǔn)備

      原圖引自《Bulletin 6305：Clarity and Clarity Max Western ECL Substrates》(Ver D)中“Fig. 3. Comparison of chemiluminescent substrate signal intensity”一節(jié)中Clarity Max測(cè)試組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的.bmp格式圖像。

      蛋白電泳實(shí)驗(yàn)：純化IKBα，上樣量700pg (band 1)，470pg (band 2)，310pg (band 3)，210pg (band 4)，140pg (band 5)，90pg (band 6)，60pg (band 7)，40pg (band 8)，30pg (band 9)；Western Blot化學(xué)發(fā)光底物為Clarity Max Western ECL Substrates（Bio-Rad）;SDS-PAGE電泳采用Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型蛋白垂直電泳系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)印采用Trans-Blot Turbo 快速蛋白轉(zhuǎn)印儀、免疫印跡分析檢測(cè)平臺(tái)為Bio-Rad ChemiDoc Western化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，曝光時(shí)間70秒。

      將圖像用Adobe Photoshop 13.0.1簡(jiǎn)體中文版執(zhí)行“圖像-調(diào)整-反相”操作（也可用Win 7的“附件-畫(huà)圖”工具進(jìn)行反相處理），“技術(shù)還原”為基于CCD原理的ECL免疫印跡成像系統(tǒng)采集到圖像的本來(lái)面目（CLIA-style）后，將圖像保存為.tif格式備用。

1.2分析軟件

       ImageJ 1.53g（Java 1.8.0-internal，32-bit，http://cnij.imjoy.io/）；

       操作系統(tǒng)win 7旗艦版(32位)，Google Chrome 瀏覽器，MS office 2010 Plus(32位)。

1.3圖像灰度值法分析操作

1.3.1 圖像分析前的調(diào)整

        啟動(dòng)網(wǎng)頁(yè)版ImageJ 1.53g后，打開(kāi)圖像文件CLIA-style.tif。

        啟用Image→Transferm→Rotate 90 Degrees Right命令，將圖像順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90°。

1.3.2 建立ROI

       采用方形工具，依次框選9個(gè)條帶，建立9個(gè)ROIs并添加到ROI Manager（ROI管理工具）中。

       測(cè)試中以圖像中各條帶為對(duì)象(Object)創(chuàng)建的ROI，詳情如下。

Table 1  Area and XY coordinates of the ROIs

       Western Blot實(shí)驗(yàn)圖像各條帶分析選區(qū)創(chuàng)建方法，可參考《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》等文章。

1.3.3背景扣除方法的創(chuàng)建

       在Process→Subtract Background下拉菜單中調(diào)出Subtract Background對(duì)話框，設(shè)定背景扣除滾動(dòng)圓球半徑（Rolling ball radius），并根據(jù)各條帶周?chē)尘扒闆r不同，勾選平滑拋物線(Sliding paraboloid，SM)、禁用smoothing算法計(jì)算背景（Disable smoothing，DSM）選項(xiàng)。

       由于所選Clarity Max Western ECL 底物標(biāo)記組圖像的背景本底不均勻，且存在大面積、強(qiáng)干擾區(qū)域，故采用“一帶一景”策略。在對(duì)所有選區(qū)評(píng)估基礎(chǔ)上，對(duì)各選區(qū)分別采用優(yōu)化背景扣除實(shí)施方案。本測(cè)試設(shè)定的背景扣除算法詳情見(jiàn)表2（在Western Blot條帶定量分析的背景扣除中如何計(jì)算滾球半徑、如何進(jìn)行條件設(shè)置和優(yōu)化的問(wèn)題另行討論，可參考《用Rolling ball為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤》、《Western Blot條帶分析中如何計(jì)算ImageJ的滾球半徑？》及《Western Blot條帶分析中如何設(shè)置ImageJ的背景扣除選項(xiàng)》等有關(guān)文章）。

Table 2  Subtract Background Command Setting of the ROIs

1.3.4 分析參數(shù)設(shè)定

       在Analyze→Set Measurements下拉菜單中調(diào)出Set Measurement勾選Area（選區(qū)），Min & max gray level（選區(qū)內(nèi)像素最小灰度值和最大灰度值），Mean gray value（選區(qū)平均灰度值），Integrated density（選區(qū)積分密度值/積分強(qiáng)度值）；Decimal places（檢測(cè)結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后位數(shù)）選0。

1.3.6 測(cè)定和保存

       在ROI Manager中左邊選中目標(biāo)ROI，點(diǎn)擊右側(cè)的Measure。將彈出Results窗口，顯示上一步選定參數(shù)的計(jì)算結(jié)果。

       點(diǎn)擊Results彈窗中的File菜單，軟件默認(rèn)保存路徑和文件名為【C：\user\當(dāng)前用戶\下載\Results.csv】,文件名可以自行命名。

       以band-1選區(qū)IntDen測(cè)試值為基準(zhǔn)，將其他band 1～band 8的強(qiáng)度值與band-1值的比值作“歸一化”處理。

       同時(shí)，按相同辦法，計(jì)算各帶原始蛋白上樣量比值。

       最后，將各選區(qū)IntDen值比值與各條帶蛋白載量比值分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，添加曲線的趨勢(shì)線和趨勢(shì)線指數(shù)方程。

2 結(jié)果

2.1條帶灰度值法測(cè)試計(jì)算結(jié)果

Table 3  Results of CLIA-style

       Table 3顯示，采用Western Blot 免疫印跡ECL化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)采集的黑底圖像獲得的選區(qū)灰度積分值比值與對(duì)應(yīng)條帶的原始蛋白上樣量比值存在高度關(guān)聯(lián)。

       根據(jù)Table 3繪制的選區(qū)灰度值比值和蛋白上樣量比值標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如下所示。

       Western Blot條帶圖像測(cè)試值與蛋白載量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

       圖像散點(diǎn)曲線圖顯示：根據(jù)各條帶選區(qū)的灰度積分值歸一化數(shù)據(jù)構(gòu)建的指數(shù)趨勢(shì)線軌跡，與依托蛋白初始上樣量數(shù)據(jù)曲線的趨勢(shì)線，軌跡存在高度吻合，兩個(gè)趨勢(shì)線方程的常數(shù)值高度接近，且各方程與趨勢(shì)線存在高度關(guān)顯著（R2＞0.998）（未完待續(xù)）。