讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-1

3 討論部分

3.1 專業(yè)電泳凝膠圖像分析軟件指南有關(guān)圖像數(shù)據(jù)值的說法

       調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分專業(yè)電泳凝膠圖像分析軟件用戶指南中，內(nèi)容設(shè)計上存在某些疏忽，的確容易引起初學(xué)者誤解和概念的混淆。
3.1.1 Bio-Rad公司的用戶指南
       伯樂Quantity One User Guide^［1］文件有眾多示例圖，均沒有注明圖片類型和來源，測試值均標示為光密度值。如：
       【5.3 Identifying and Editing Individual Bands】圖Fig. 5-7，條帶峰值顯示為Optical Density；
       【5.7 Gauss-Modeling Bands】圖Fig. 5-13，圖像背景指標值為Uncalib. Optical Density；
       【10.1 Report Window】中圖Fig. 10-2 Example of a report window的protein report，采用Peak OD、Average OD測試值。
       這些現(xiàn)象，使人們?nèi)菀桩a(chǎn)生protein-OD值關(guān)聯(lián)的直覺。

        但實情是，Quantity One用intensity of the pixels指代電泳條帶、凝膠的背景測試值，文件【10.6 Volume Analysis Report】和【4.1.e Lane Profile】兩處皆是。
       此后發(fā)布的Image Lab Software User Guide^［2］文件，這方面就改進了。

       【Chapter 3 Image Lab Software Overview】一節(jié)明確指出：
       Main Window狀態(tài)顯示欄顯示的測試值分為intensity (Int)和optical density (OD)兩種，數(shù)字范圍為0–65535 (16比特) 或0.0–4.0 (OD)。
       可見，Image Lab Software User Guide對圖像灰度值與光密度的概念是有嚴格區(qū)分的。

      
3.1.2 美國Alpha公司發(fā)布的指南文件
       AlphaView Software User Guide^［3］中Multiplex Band Analysis】、【Lane Profile】、【Analyzing Arrays】和【Measuring Density】等多個章節(jié)中多次采用含有density一詞的表述。譬如，density of bands，density value，Measuring Density，pixel density等。望文生義容易給人誤覺，以為指代測試值用的密度（Density）正是光密度（Optical Density）的略稱。
       其實，該指南在【Contrast Adjustments】 、【Appendix B: Data Description Tables】等處明確測試值為圖像灰度值pixel gray levels。在【Histogram】 一節(jié)專門對圖像灰度gray levels做了科普性闡述。

       除density，指南還使用pixel intensity指代圖像測試值。
       這說明，Alpha公司指南中，電泳條帶分析中對于圖像灰度值和光密度值概念使用是很明確的。

3.1.3 UVP公司《LS Software User Guide》
UVP的《LS Software User Guide》 ^［4］在“通則”部分用intensity指代測試值。
       gray levels僅出現(xiàn)在【Image Acquisition】一節(jié)，而density則見諸于【Area Density Analysis】和【Estimate Region Volume】兩個模塊有關(guān)篇幅。
       但須指出，該指南在【Perform Area Density Analysis】中【Area Density Results Definitions: "Density List" Tab】中指出，ROI測試值Total Density/Intensity分兩種，即灰度值（Grey-Levels，GL) 或光密度值（Optical Density，OD)。具體測試值的選擇須依Intensity Calibration curve校準類型而定。
       可喜的是，該指南還對Optical Density、Grey Levels兩種實驗圖像測試值的適用對象做了明確規(guī)定。實質(zhì)內(nèi)容與ImageJ用戶指南^［5］一致。

       歸納起來，專業(yè)凝膠圖像分析廠家的技術(shù)指南文件中，圖像強度分析數(shù)值分為圖像灰度值（GL) 和光密度值（OD)兩種，二者可統(tǒng)一用density（密度）或Intensity（強度）指代。

       density并非專指Optical Density（光密度值，OD），要視具體分析的圖像類型而定。蛋白考馬斯亮藍染色凝膠、銀染凝膠圖像和Western Blot實驗中ECL法檢測原始圖像，分析所用的圖像強度值涵義是不一樣的。因此，不可離開具體圖像類型，把光密度（Optical Density)與密度（density）混為一談，更不能把所有電泳凝膠有關(guān)的圖像分析，不加區(qū)分二簡單地冠以圖像光密度或者圖像灰度值。

3.2 Western Blot條帶蛋白定量分析中圖像強度值概念問題

       關(guān)于OD值和GL值的概念和運用，可參考《光密度值和灰度值如何在Western Blot條帶定量和凝膠圖像分析中應(yīng)用?》一文。簡而言之，就Western Blot實驗圖像分析應(yīng)用而言，可以總結(jié)為以下3個要點。
       1）光密度Optical Density或密度density：可用于指代經(jīng)典放射性自顯影成像技術(shù)獲得的膠片、膠片經(jīng)透射型掃描儀掃描獲得的亮底暗帶型圖像的強度值；
       2）目前普遍使用的ECL發(fā)光檢測功能Western Blot印跡成像分析系統(tǒng)，其采集的亮帶暗背景原始圖像經(jīng)反相處理為亮底暗條帶型仿底片圖像強度值，用光密度Optical Density指代是對的；
       3）放射性自顯影曝光后沖洗所得的暗底白條帶照片圖像，還是ECL印跡成像系統(tǒng)采集的暗底白條帶原始圖像，應(yīng)用“灰度（Grey-Levels)”或“密度density”值指代圖像強度值。
       

3.3 圖像灰度值應(yīng)用于Western Blot條帶定量分析的可行性

       本次實測的圖像源自伯樂ChemiDoc MP Western熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集，但參考業(yè)界發(fā)文習(xí)慣做法，原圖已處理為亮底暗條帶的仿底片圖像?；?.2的討論，須將發(fā)表圖像再次反相處理，以還原為ChemiDoc MP系統(tǒng)采集的原圖效果，方可用于圖像灰度值分析。

       依托條帶創(chuàng)建ROI取得像素灰度值散點曲線圖和指數(shù)型趨勢線，顯示高度相關(guān)（R²＞0.998），并且該趨勢線與電泳時蛋白初始載量歸一化數(shù)據(jù)的趨勢線（R²＞0.999）軌跡高度一致。趨勢線指數(shù)方程的各指數(shù)常數(shù)高度接近，表明從圖像逆向分析，通過分析圖像灰度值數(shù)據(jù)，非常成功地再現(xiàn)了蛋白電泳初始載量數(shù)量對比關(guān)系。

       提示：在Western Blot實驗中，直接采用ECL化學(xué)發(fā)光成像平臺采集的暗底白帶原圖，基于圖像灰度值指標進行分析，合理且可行。

      結(jié)合其他多次類似圖像的實測結(jié)果（未總結(jié)發(fā)布），足以驗證ImageJ等專業(yè)圖像分析軟件的指南對Western Blot ECL化學(xué)發(fā)光圖像分析數(shù)值類型選擇指導(dǎo)意見的正確性。 

3.4 總結(jié)

       Western Blot實驗由于早期使用的是放射性自顯影成像檢測技術(shù)，圖像曝光后的底片圖像為白底暗帶形式。而目前，采用CCD-化學(xué)發(fā)光成像檢測技術(shù)已大行其道。但WB實驗結(jié)果發(fā)表時，為照顧業(yè)已約定成俗、根深蒂固的“審黑”習(xí)慣，依然采用仿自顯影底片圖像。

       假作真時真亦假。把未經(jīng)反相處理的原圖本色發(fā)表，反而顯得違和感太強，變成了一種錯誤的“正確”。

       在正式發(fā)文中，在描述圖像強度值時，如有必要，采用的是圖像灰度還是光密度值進行的分析，措辭須份外留神。不可正對仿底片型圖像大談圖像灰度值分析，以致鑄成高水平論文中“圖片使用不當”的“院士級”錯誤！

      基于圖像灰度值分析反向再現(xiàn)Western Blot條帶蛋白初始載量精確數(shù)量關(guān)系的實測結(jié)果說明，基于化學(xué)發(fā)光CCD成像分析系統(tǒng)采集的原圖灰度值數(shù)據(jù)直接進行蛋白條帶定量分析的方法，技術(shù)原理上合理，操作上靠譜，結(jié)果上完全可以達到分析目的。

     實測中屢戰(zhàn)屢被的經(jīng)歷告訴我們，Western Blot實驗圖像均存在復(fù)雜、不均勻、干擾背景偏高的現(xiàn)實條件下，用ImageJ軟件對圖像定量分析，從ROI創(chuàng)建到選區(qū)背景扣除的全過程是一個極具挑戰(zhàn)的過程。

       感悟就是：ROI合理設(shè)置是基礎(chǔ)，背景扣除設(shè)置條件的有效是關(guān)鍵。

       關(guān)于如何在WB條帶定量中設(shè)置好分析選區(qū)的具體操作技術(shù)問題，可參考阿拉斯科技(8008088118.cn)《百家論壇》欄目發(fā)表的《ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶定量分析選區(qū)的基本規(guī)則》和《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》等文章。

參考文獻

1. Bio-Rad Quantity One User Guide for Version 4.4

2. Bio-Rad Image Lab Software User Guide Version 6.1

3. AlphaView Software User Guide_94-13934-00 Revision 3a (2011)

4. Life Science Software Installation and User Instructions (81-0254-01 Rev L)

5. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)

6. Bulletin 6305：Clarity and Clarity Max Western ECL Substrates, Ver. D