讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-3

       ImageJ軟件用于Western Blot條帶定量分析，首先要?jiǎng)?chuàng)建分析選區(qū)（ROI）。選區(qū)既是框定了被分析對(duì)象圖像信號(hào)分布的范圍，也等于設(shè)定了圖像背景基線、確定了圖像背景扣除的滾球半徑。因此，科學(xué)合理的ROI創(chuàng)建，是條帶分析數(shù)據(jù)客觀有效、確保后續(xù)分析不偏離正常航向的燈塔。
       為WB條帶建立ROI操作，可分為4個(gè)基本步驟：圖像準(zhǔn)備，ROI邊界范圍評(píng)估，正式創(chuàng)建ROI和ROIs方案保存。 

一、圖像的準(zhǔn)備

        因Western Blot實(shí)驗(yàn)條件系統(tǒng)和操作者個(gè)人經(jīng)驗(yàn)技術(shù)等因素，WB實(shí)驗(yàn)圖像的條帶位置排列難以整齊劃一，往往傾斜，形如翹板，相互間參差不齊。

       采用圖像分析軟件的旋轉(zhuǎn)功能，有可能會(huì)對(duì)條帶的圖像分析結(jié)果產(chǎn)生偏差。這一點(diǎn)，有興趣的讀者可以參考《圖像旋轉(zhuǎn)操作對(duì)Western Blot條帶定量分析影響的評(píng)估與對(duì)策》一文。因此，我們并不主張對(duì)WB原始條帶圖像濫用旋轉(zhuǎn)校正功能。

       將原圖的副本保存為.Tif格式備用即可。若基于條帶的圖像灰度值進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，對(duì)于暗條亮底圖像反相轉(zhuǎn)換為亮條暗底型后保存。

二、ROI理論邊界范圍評(píng)估

       打開(kāi)待分析的Western Blot條帶圖像。

       對(duì)于條帶外形規(guī)則的WB條帶，可首選方形選框(Rectangular Selection Tool)“圈地”，便于后續(xù)簡(jiǎn)單地移動(dòng)后套用及隨時(shí)自由地縮放ROI框選范圍。
       多邊形選區(qū)工具(Polygon Selection Tool)、自由手繪工具(Freehand Selection Tool)，具有“因勢(shì)利形”的優(yōu)勢(shì)，可用于“笑臉”形、“啞鈴”形等不規(guī)則條帶的圈選，便于“量身定制”去除背景像素。不足之處在于，這種ROI將無(wú)法調(diào)用Plot Profile功能模塊。

       
       WB條帶分析選區(qū)ROI理論邊界范圍的評(píng)估，包括以下流程。
2.1 啟動(dòng)Plot Profile分析模塊
       點(diǎn)擊主界面的【Analyze】→【Plot Profile】菜單命令，調(diào)出【Plot Profile】窗口并激活實(shí)時(shí)顯示功能。
       選擇圖像中條帶亮度高同時(shí)邊界清晰的一條下手。

2.2 建立ROI試驗(yàn)選區(qū)
       從目標(biāo)條帶中選較“干凈”的一小段，建立ROI “先行試驗(yàn)區(qū)”。
       試驗(yàn)區(qū)的高度H，根據(jù)用《ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則》的介紹，采用1行或多行像素均可，視條帶圖像具體條件而定。初始寬度W，原則是力求總攬全局，便于整體預(yù)判。
       判斷條帶有效信號(hào)覆蓋范圍，要依靠Plot Profile窗口的信號(hào)強(qiáng)度分布曲線圖，從ROI試驗(yàn)區(qū)信號(hào)主峰的左右兩翼外圍曲線走勢(shì)突然轉(zhuǎn)平或向上折返為標(biāo)志，判定為信號(hào)強(qiáng)度和組成變化的拐點(diǎn)。拐點(diǎn)試驗(yàn)區(qū)邊界的臨時(shí)紅線，但并非選區(qū)的最終有效邊界。
       以像素列為單位，以左右兩側(cè)曲線的拐點(diǎn)為界，由兩側(cè)向中心把曲線覆蓋區(qū)域依次分為背景區(qū)、緩沖區(qū)和理論檢測(cè)信號(hào)區(qū)。左側(cè)拐點(diǎn)曲線變化劇烈，通?？梢暈樾盘?hào)與背景臨時(shí)分界線。右側(cè)拐點(diǎn)附近曲線趨勢(shì)平緩。藍(lán)色區(qū)域曲線的走勢(shì)，在后續(xù)隨著ROI擴(kuò)大，通常會(huì)因背景信號(hào)成份加入而進(jìn)一步變緩，最終轉(zhuǎn)變?yōu)楸尘皡^(qū)而被排除，故劃為緩沖區(qū)。
       據(jù)此初步判斷，該條帶位置位于x4 - x23區(qū)間，此范圍即后續(xù)ROI的紅線。

       以下是實(shí)際工作中常見(jiàn)的條帶信號(hào)分布曲線圖的幾種拐點(diǎn)標(biāo)志。

       實(shí)際實(shí)驗(yàn)圖像中，一側(cè)曲線邊緣呈現(xiàn)雙重拐點(diǎn)標(biāo)志的情況，亦不罕見(jiàn)。這種情況下，應(yīng)以離主峰最近的拐點(diǎn)計(jì)算紅線。

       ROI試驗(yàn)性評(píng)估步驟，對(duì)于強(qiáng)背景干擾條帶、弱信號(hào)條帶和像素不規(guī)律分布或/斷裂型弱信號(hào)條帶ROI創(chuàng)建中有效邊界判定，具有重要指導(dǎo)意義。

三、在ROI試驗(yàn)區(qū)上擴(kuò)展創(chuàng)建正式ROI

        良好的開(kāi)端是成功的一半。
       而創(chuàng)建科學(xué)合理的Western Blot條帶分析選區(qū)，對(duì)于分析數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)可靠所發(fā)揮的作用，恐怕要超過(guò)一半。
       精確界定ROI范圍，通常需要在ROI實(shí)驗(yàn)區(qū)的基礎(chǔ)上，經(jīng)歷幾個(gè)環(huán)節(jié)的精雕細(xì)琢，選區(qū)的創(chuàng)建才能趨于合理。
3.1 確認(rèn)選區(qū)的高度
       選區(qū)的高度，即條帶長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度。
       保持即有ROI試驗(yàn)區(qū)的左右邊界坐標(biāo)不變、寬度不變，移動(dòng)上、下邊框，調(diào)整選區(qū)高度，直至選區(qū)足夠覆蓋比目視下條帶上下邊界即可。
       當(dāng)條帶信號(hào)弱而背景強(qiáng)，條帶間起止界限不容易肉眼判別時(shí)，可參考兩個(gè)辦法來(lái)確定：
       1）圖像旋轉(zhuǎn)90°后，在Plot  Profile窗口，矩形選框同時(shí)圈定2個(gè)相鄰條帶，從兩個(gè)主峰之間曲線走勢(shì)低谷，找出交界地點(diǎn)；
       2）根據(jù)圖像上條帶最清晰的兩個(gè)相鄰條帶各自長(zhǎng)軸長(zhǎng)度和條帶間隔大小，判定其余條帶的大致位置分布和長(zhǎng)度。
不同條帶的ROI高度，視實(shí)驗(yàn)和圖像條件，可能存在1-4個(gè)像素的差異。

3.2 優(yōu)化選區(qū)的寬度
       選區(qū)精確界定是個(gè)精細(xì)的活。
       通常，隨著ROI試驗(yàn)區(qū)上下選框擴(kuò)張，Plot Profile顯示強(qiáng)度分布曲線主峰的兩翼的曲線部分會(huì)發(fā)生明顯改變：或變得更平緩或出現(xiàn)新的拐點(diǎn)。此時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步收窄ROI范圍到新拐點(diǎn)。但接下來(lái)有2個(gè)細(xì)節(jié)，是需要妥善處置的。
3.2.1在Plot圖上精確判定條帶有效信號(hào)分布邊界
       先看一幅圖，有助于對(duì)ROI創(chuàng)建規(guī)則有更深入清晰的概念。用柱狀圖高度代表像素列強(qiáng)度，Plot Profile相當(dāng)于將每列像素的柱頂連接形成常見(jiàn)Plot曲線圖。圖中框選了21列像素，對(duì)應(yīng)的水平坐標(biāo)值分別標(biāo)示為0-20。

         根據(jù)曲線圖主峰兩翼末端外圍1-2列像素強(qiáng)度值曲線，評(píng)估目前選區(qū)范圍圖像背景強(qiáng)度水平（如圖中的虛線所示）。將強(qiáng)度高于背景水平線的像素列視為有效信號(hào)。
        此時(shí)可初步認(rèn)定，選區(qū)信號(hào)分布范圍介于3-17號(hào)像素列。
        觀察發(fā)現(xiàn)：此時(shí)確定的選區(qū)范圍，相當(dāng)于從拐點(diǎn)出發(fā)左右各縮進(jìn)一列像素后范圍。這正是本文前面提到的，拐點(diǎn)只能作為選區(qū)的初始紅線而不能以曲線拐點(diǎn)作為邊界的道理。

3.2.2 結(jié)合圖像上條帶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)優(yōu)化選區(qū)
       在選區(qū)創(chuàng)建中，Plot Profile只能算老司機(jī)的車載導(dǎo)航儀。由于曲線依據(jù)像素列的強(qiáng)度均值而呈現(xiàn)，但并沒(méi)有區(qū)分背景和信號(hào)組成比例的功能。完全依賴Plot圖設(shè)定ROI，輕則夸大選區(qū)分析值，重則誤導(dǎo)分析結(jié)論。
       實(shí)際操作中，還要綜合條帶圖像邊緣部分像素列結(jié)構(gòu)的完整性、圖像周圍背景分布，才能有效確認(rèn)條帶選區(qū)邊界。
       通常，條帶邊緣像素列的斷裂痕跡是可靠的定位參考標(biāo)志物。

       如圖所示，所謂的像素列斷痕，就是用綠、橙、紅色標(biāo)示的像素。這些像素信號(hào)由于自身強(qiáng)度劇減，使具有相同水平坐標(biāo)的像素群組成的像素列表現(xiàn)出縱向“斷裂的痕跡”。
       其中靠條帶內(nèi)側(cè)的綠色“斷裂帶”夾雜明顯有效信號(hào)像素，橙色斷裂帶則無(wú)肉眼可充分辨識(shí)的有效信號(hào)像素，但未見(jiàn)背景像素。而紅色“斷裂帶”中則可見(jiàn)為數(shù)不少的背景像素。
       通常，判定ROI是否符合IiamgeJ軟件分析要求，以下兩條建議可以參考。
       1）條帶選區(qū)兩側(cè)的邊緣，不應(yīng)包含肉眼可直觀判識(shí)的背景像素。
       在遇見(jiàn)條帶邊緣的某個(gè)弱信號(hào)像素列，到底應(yīng)算作有效信號(hào)還是視為背景須從選區(qū)排除而難以取舍時(shí)，可以該列像素是否包含背景像素作為劃分標(biāo)準(zhǔn)和底限。
       2）合格ROI選區(qū)的Plot Profile曲線特征是：信號(hào)主峰兩翼末段的曲線，應(yīng)以一定斜率“接地”或呈向下傾斜態(tài)勢(shì)。
       如末段呈現(xiàn)上樣或水平狀態(tài)，有悖于WB條帶信號(hào)分布一般規(guī)律，應(yīng)予調(diào)整。

       ROI設(shè)置完成后，點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵，在彈出菜單中點(diǎn)擊“Add to ROI Manager”，系統(tǒng)自動(dòng)彈出ROI Manager面板。
       為便于管理和記憶，ROI的數(shù)字名稱可用Rename命令更名。 

四、ROIs方案保存和管理

4.1 ROIs保存
        為便于進(jìn)一步分析和資料整理，避免每次花費(fèi)大量精力重建選區(qū)，全部條帶完成ROI創(chuàng)建后，在ROI Manager窗口確認(rèn)【show all】激活和全部ROI呈現(xiàn)在圖像上后，點(diǎn)擊軟件File菜單，軟件的Overlay功能將ROIs信息疊加在圖像上。
       選擇一個(gè)便于管理記憶名稱，以Tif格式保存圖像操作結(jié)果。

       需要注意的是，無(wú)論是網(wǎng)絡(luò)版還是脫機(jī)版，ImageJ軟件默認(rèn)保存路徑是windows系統(tǒng)下默認(rèn)的下載文件夾。下次原路徑下打開(kāi)圖像后，已經(jīng)創(chuàng)建完的ROIs會(huì)自動(dòng)呈現(xiàn)，并可進(jìn)一步編輯和分析。

4.2 ROIs設(shè)置的復(fù)制轉(zhuǎn)移

       創(chuàng)建的ROIs設(shè)置可以被復(fù)制套用到新的空白圖像中。方法是：

       A.打開(kāi)已創(chuàng)建ROIs設(shè)置并保存的圖像；

       B.激活ROI創(chuàng)建工具中的方形選框，依次點(diǎn)擊激活每個(gè)ROI。此時(shí)，ROI黃色邊框轉(zhuǎn)換為帶調(diào)節(jié)按鈕的形式，執(zhí)行Add to ROI Manager操作；

       C.打開(kāi)相同規(guī)格的新圖像后（要求兩幅圖像尺寸一致，同時(shí)條帶形狀、位置及大小一致），點(diǎn)擊ROI Manager中【show all】或同時(shí)勾選【labels】選項(xiàng)后，上一幅圖的ROIs設(shè)置將在新圖像中精確再現(xiàn)。

       當(dāng)打開(kāi)多幅圖像后，只有其中一幅圖像處于激活狀態(tài)。點(diǎn)擊要分析的一張圖，則另一張圖將自動(dòng)退出激活模式。通過(guò)簡(jiǎn)單鼠標(biāo)點(diǎn)擊切換，可隨時(shí)分析兩幅圖中ROIs。

       D.把需要對(duì)比的兩個(gè)不同ROI分別激活，分別執(zhí)行Measure→Plot profile命令，可同時(shí)顯示兩個(gè)ROI的峰形圖。

       分別執(zhí)行Measure，可調(diào)出共同Results窗口，計(jì)算結(jié)果按激活順序顯示在同一個(gè)窗口，便于比對(duì)分析。該功能適用于同批次實(shí)驗(yàn)中不同圖像之間的比較。

參考文獻(xiàn)

1. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)

2. ImageJ創(chuàng)建Western Blot條帶分析選區(qū)的基本規(guī)則