悟凝膠成像儀性能為圖像分析開新局-4

       菌落(colony)又稱細(xì)菌集落，是由同種微生物的單個菌體或孢子在一定培養(yǎng)條件、一定固體培養(yǎng)基上生長繁殖后形成的肉眼可見的聚集體。

       現(xiàn)行國標(biāo)規(guī)定：可手工或用菌落計數(shù)器測定菌落的數(shù)量，計數(shù)單位為CFU (colony-forming units)，以cfu/g或cfu/mL值表示被檢樣品的微生物菌落總數(shù)。

       凝膠成像分析系統(tǒng)，除主要用于常規(guī)電泳凝膠圖像采集與分析外，廠家技術(shù)資料常提及Colony counting，即細(xì)菌菌落計數(shù)、克隆計數(shù)功能。但實際工作中，用凝膠成像分析儀進行克隆計數(shù)的較為少見。這是因凝膠成像分析系統(tǒng)在菌落計數(shù)功能上存在諸多短板難以滿足計數(shù)要求，還是緣于業(yè)內(nèi)長期以來菌落計數(shù)使用習(xí)慣所致？

一、國家技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)對菌落計數(shù)的要求
       現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)文件中的微生物菌落總數(shù)檢驗的規(guī)范流程規(guī)定，可用肉眼或放大鏡輔助觀察法直接標(biāo)記計數(shù)，或采用菌落計數(shù)器進行計數(shù)。
       其中有兩個文件的局部內(nèi)容與菌落計數(shù)器的使用有關(guān)。
1.1 《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法》
       《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法》中的菌落計數(shù)部分規(guī)定：
       【細(xì)菌種類繁多、差別大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落?！?br/>       【平板上2個或多個菌落重疊，若可區(qū)分開則應(yīng)以2個或多個菌落計數(shù)?！?
       可見，菌落計數(shù)器的使用至少有三個要點：
       菌落計數(shù)用光源：透射或反射白光源均可滿足要求，透射白光更佳；
       菌落計數(shù)選區(qū)設(shè)定：選區(qū)范圍應(yīng)覆蓋培養(yǎng)皿底部整個培養(yǎng)面；
       重疊菌落的分割：對距離近而相互粘連菌落的分割計數(shù)。

1.2 菌落計數(shù)器校準(zhǔn)規(guī)范
       盡管菌落計數(shù)器的技術(shù)性能、使用規(guī)程尚無國家標(biāo)準(zhǔn)。但已先行頒布了《JJF 1751-2019 菌落計數(shù)器校準(zhǔn)規(guī)范》。
       規(guī)范所列的菌落計數(shù)器校準(zhǔn)事項中包括：
1.2.1 菌落計數(shù)器功能
       菌落計數(shù)器是可對經(jīng)處理培養(yǎng)皿上菌落自動分析計數(shù)的儀器，由光源、CCD圖像傳感器、圖像處理系統(tǒng)及計數(shù)顯示設(shè)備等。分析時彩色圖像傳感器獲取培養(yǎng)皿圖像，專業(yè)軟件對圖像中的菌落進行分析識別和統(tǒng)計,從而獲得培養(yǎng)皿上的菌落總數(shù)。
1.2.2 校準(zhǔn)規(guī)范適用范圍
       適用于具有掃描成像系統(tǒng)并根據(jù)圖像自動進行計數(shù)的菌落計數(shù)器及其他類型的菌落計數(shù)器的校準(zhǔn)。
1.2.3 菌落計數(shù)儀器校準(zhǔn)項目
       鑒別力：用儀器可識別的最小菌落的直徑表示菌落計數(shù)器的最小菌落的識別能力。
       分辨率：數(shù)碼成像系統(tǒng)或成像組件分辨圖像細(xì)節(jié)能力。

二、凝膠成像分析系統(tǒng)的硬件實力
       正如《如何有效評價凝膠成像分析系統(tǒng)的技術(shù)性能-透射白光的配置應(yīng)用》文中所述，凝膠成像分析系統(tǒng)通常標(biāo)配有反射型白色光源，還可視實驗需要加配透射型白光光源。

       凝膠成像系統(tǒng)再充分發(fā)揮自身高分辨率圖像采集功能，故硬件上足以滿足常規(guī)菌落計數(shù)應(yīng)用的技術(shù)要求。
1）應(yīng)用的合理性
       凝膠成像分析系統(tǒng)的硬件組成、圖像采集和分析工作模式，已具備《菌落計數(shù)器校準(zhǔn)規(guī)范》界定菌落自動計數(shù)類儀器的全部特征和功能。因此，是可以名正言順地納入菌落計數(shù)類儀器范疇的。
2）技術(shù)的可行性
       多數(shù)菌體的單體需借助光學(xué)顯微鏡放大數(shù)十倍后才能現(xiàn)形。但成千上萬的細(xì)菌聚集生長形成的菌落，則足以憑肉眼即可輕松分辨和觀察。資料顯示，按食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗規(guī)范指定培養(yǎng)條件，金黃色葡萄球菌所形成的圓形菌落直徑2-3mm。而經(jīng)驗表明，大腸桿菌經(jīng)LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18小時所形成菌落的直徑可達(dá)1.5-2.0mm。
       就凝膠成像分析系統(tǒng)的圖像分辨能力看，早在2000年前后上市的伯樂Gel Doc 2000系統(tǒng)（CCD分辨率768H×494V像素，最大成像面積25×26cm），對應(yīng)于被分析樣品上，其幾何尺寸區(qū)分能力就已達(dá)0.5mm，足以分辨直徑1.0mm大小的實驗培養(yǎng)菌落。而新型凝膠成像分析系統(tǒng)，如伯樂GelDoc Go凝膠成像分析儀（630萬像素，最大圖像區(qū)域14L×21W cm），國產(chǎn)勤翔GenoSens 2000系列凝膠成像分析儀（605萬像素/2048×2560 pxls、最大圖像區(qū)域19L×26W cm），對實物上兩點間距的分辨能力已升至0.1mm以內(nèi)，這對于可靠捕獲絕大多數(shù)實驗培養(yǎng)菌菌落圖像的任務(wù)，已是綽綽有余。
       因此，在凝膠成像分析系統(tǒng)上進行常規(guī)菌落計數(shù)工作，可謂合情合理，水到渠成。

三、凝膠成像分析系統(tǒng)的菌落計數(shù)功能原理
       凝膠成像系統(tǒng)圖像分析軟件的菌落計數(shù)功能，是基于靈活高效圖像采集控制與強大的圖像分析能力實現(xiàn)的。
       圖像分析系統(tǒng)對菌落的識別與常規(guī)電泳凝膠圖像中泳道和條帶的自動識別，原理異曲同工。都是在劃定的選區(qū)內(nèi)基于分析對象與圖像背景的灰度值差異來對目標(biāo)所處位置、面積大小和色彩進行自動識別與統(tǒng)計。
       在菌落計數(shù)中，軟件對培養(yǎng)皿上的菌落與周圍培養(yǎng)基區(qū)域的局部像素強度值峰和信號分布范圍，結(jié)合人工設(shè)定的強度閾值（density thresholds），完成對菌落判別、顏色的區(qū)分、直徑大小以及菌落數(shù)量的自動統(tǒng)計。

 （待續(xù)）