悟凝膠成像儀性能為圖像分析開新局-4

四、凝膠成像分析軟件的菌落計數(shù)分析功能類型
       歸納起來，專業(yè)凝膠圖像分析軟件可提供多種菌落定量分析功能，滿足不同類型微生物菌落檢測需求。
4.1 自動計數(shù)、預(yù)設(shè)模板計數(shù)和手動計數(shù)
       自動計數(shù)功能（Automatic Counting）：調(diào)整好圖像大小，使用矩形、橢圓、多邊形工具定義分析區(qū)域范圍，選擇"自動計數(shù)"菜單，系統(tǒng)將自動完成選區(qū)內(nèi)全部菌落計數(shù)，并在圖像上顯示。
       與之類似，在預(yù)設(shè)模板分析模式（Template Counting）下，調(diào)用預(yù)設(shè)條件模板，軟件將按模板設(shè)置要求自動完成菌落分析統(tǒng)計。
       手動計數(shù)（Click and Add Counting），人工肉眼識別圖像上的菌落，手工逐一“點選”，被選中的菌落自動突出顯示并以數(shù)字標(biāo)示，在完成菌落計數(shù)后，軟件給出計數(shù)圖像分布與統(tǒng)計結(jié)果。

4.2 顏色分類計數(shù)
       菌落外形特征是辨認菌種的重要依據(jù)。細菌、酵母、霉菌等不同類型微生物，在不同培養(yǎng)基上形成外觀特征，如菌落大小、形狀、邊緣、顏色、光澤和透明程度等，存在差異。而同種細菌、在相同培養(yǎng)條件下形成的菌落特征具有穩(wěn)定性。
       在Identify by Color Counting計數(shù)模式下，軟件可按顏色區(qū)分不同菌落，并根據(jù)顏色屬性分類統(tǒng)計。一次分析可完成培養(yǎng)皿中不同類型菌落檢測計數(shù)。
       在定義計數(shù)選區(qū)，選中第一重顏色菌落后，系統(tǒng)自動識別和計算所有與采樣點相同顏色的菌落。通過分類添加操作，可進一步定義和自動分析其他菌落類型，直至完成選區(qū)的全部菌落。

4.3 區(qū)帶分析
       區(qū)帶分析（Zone analysis）功能可提供圖像選內(nèi)各個獨立菌落分布范圍的面積、直徑大小統(tǒng)計信息，常用于抗菌和抑菌效果評價實驗中被檢樣品的抑制圈直徑大小的測量等檢測。

4.4 選區(qū)排除計數(shù)
       國標(biāo)對于菌落計數(shù)選區(qū)的選擇有明確技術(shù)要求。
       《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗-菌落總數(shù)測定》規(guī)定：以無片狀菌落生長的平板進行菌落計數(shù)；若成片狀生長的菌落比例不到平板培養(yǎng)面積的一半,而另一半?yún)^(qū)域菌落分布均勻,則可計算半個平板后乘以2,代表該平板菌落總數(shù)。
       如培養(yǎng)皿的特定區(qū)域圖像有污損，不符合計數(shù)要求，或?qū)嶒炚卟幌雽⑦@部分菌落列入最終計數(shù)結(jié)果中，則可通過某些在凝膠成像分析軟件的"忽略區(qū)域"命令（Ignore Region），將該圖像區(qū)域排除在計數(shù)選區(qū)外。
       經(jīng)驗人士指出，實驗中應(yīng)盡量避免在培養(yǎng)皿的底面寫字標(biāo)記。除非在計數(shù)前圖像經(jīng)適當(dāng)處理消除字跡，否則字跡部分會被錯誤地識別為菌落，干擾計數(shù)結(jié)果。

4.5 螺旋平板計數(shù)
       螺旋接種法，是政府微生物專業(yè)檢測機構(gòu)、食品藥品和化妝品生產(chǎn)企業(yè)進行樣品菌落總數(shù)檢測、培養(yǎng)基質(zhì)控中常用接種手段，已被FDA、AOAC、APHA、ISO 7218、我國GB 4789.28-2013及SN/T 2098-2008等收錄。
       螺旋板計數(shù)功能，Spiral Counting，正是針對螺線平板接種法開發(fā)的自動計數(shù)模塊。
       執(zhí)行螺旋板分析命令，系統(tǒng)生存一張阿基米德螺旋形網(wǎng)格疊加在計數(shù)圖像上。移動和調(diào)整網(wǎng)格到大小和位置實現(xiàn)螺旋網(wǎng)格中心與螺旋平板圖像中心準(zhǔn)確對齊，軟件將顯示螺旋板分析窗口并可自動顯示計數(shù)結(jié)果。

4.6 計數(shù)條件設(shè)定和修正
       《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法》規(guī)定：
       1）須區(qū)分細菌菌落或培養(yǎng)基沉淀物，剔除被錯誤識別為菌落的圖像背景計數(shù)；
       2）平板上有2個或多個菌落存在重疊，在可有效分辨的情況下應(yīng)按2個或多個菌落計計算。
       為確保菌落計數(shù)器或人工計數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性、減少誤差，需設(shè)定合理分析條件，且在必要時執(zhí)行增加/刪除、分割（Split Colonies）/合并菌落（Merging Colonies）操作。
       凝膠成像分析軟件的菌落計數(shù)模塊，設(shè)置有多個計數(shù)條件設(shè)置選項和修正計數(shù)功能，足以勝任菌落計數(shù)過程的質(zhì)控管理任務(wù)。
4.6.1 菌落分割/合并功能
       當(dāng)兩個或多個菌落距離太近而被軟件識別為一個菌落時，可通過Manual Split Colonies命令手工操作或借助于Auto Split Colonies命令自動實現(xiàn)黏連菌落的分割。
       當(dāng)一個菌落被錯誤地識別為兩個獨立菌落時，可以通過Merging Colonies命令手動合并兩個菌落。

4.6.2 菌落圖像強度閾值設(shè)置
       軟件的自動計數(shù)是基于分析對象與圖像背景的灰度值的差異，如培養(yǎng)皿上菌落比周圍區(qū)域更暗或更亮。而圖像強度閾值（Density Thresholds）設(shè)置規(guī)定了分析對象圖像灰度值的范圍。軟件將圖像中像素強度處于高、低兩個閾值之間的分析對象視為細菌菌落統(tǒng)計，提高計數(shù)準(zhǔn)確性。

4.6.3 設(shè)置菌落大小尺寸
       圖像分析對象大小不同，如僅需對特定大小的菌落計數(shù)，可使用區(qū)域控制（Area Controls）命令，設(shè)定被統(tǒng)計菌落的直徑大小范圍，則直徑值處于設(shè)定區(qū)間的對象視為計數(shù)對象。

4.6.4 用直方圖區(qū)分菌落
       凝膠成像分析軟件菌落計數(shù)模塊，可用直方圖顯示檢測到的全部菌落圖像信號強度分布范圍。如果圖像中有白色、藍色兩種菌落，則直方圖上會顯示兩個清晰信號峰。
       直方圖計數(shù)窗口設(shè)有控制滑塊，可設(shè)置菌落-圖像背景、白色與藍色信號強度值界限。拖動滑塊時，菌落數(shù)量、白色、藍色菌落的數(shù)量將自動調(diào)整。

五、討論
       凝膠成像分析軟件依托自身強大圖像量化分析算法，為菌落計數(shù)提供了全面的菌落分類和量化信息，包括菌落的種類數(shù)、每類菌落數(shù)量和類百分比；菌落整體和每類菌落的面積、菌落周長、菌落平均直徑和菌落圓度(numerically depicts roundness of the colony)統(tǒng)計數(shù)據(jù)等。就功能和適用性而言，與全自動菌落計數(shù)儀難分伯仲。因此，充分發(fā)揮實驗室既有凝膠成像分析平臺資源，開展常規(guī)微生物菌落計數(shù)工作，科學(xué)合理，簡便易行。
       無須諱言，不同品牌凝膠成像分析系統(tǒng)軟件集成的菌落計數(shù)功能模塊種類、數(shù)量存在區(qū)別，分析條件設(shè)置要求也不盡相同。
       此外，凝膠成像分析系統(tǒng)自身硬件條件所限，無法使用新型自動菌落計數(shù)儀裝備的暗視野底部透射光源（下光源），菌落表面立體細節(jié)呈現(xiàn)效果不佳。部分機型LED反射白光色溫偏冷，一定程度上影響對菌落真實色澤的還原。

參考文獻
［1］ GB4789.2-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定
［2］ GB/T 16293-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌的測試方法
［3］ WS/T 650-2019 抗菌和抑菌效果評價方法
［4］ JJF 1751-2019 菌落計數(shù)器校準(zhǔn)規(guī)范
［5］ Life Science Software Installation and User Instructions, Rev L
［6］ Quantity One User Guide for Version 4.4, Rev A
［7］ AlphaView Software User Guide, Revision 3A