悟凝膠成像儀性能為圖像分析開(kāi)新局-3

一、白光光源在凝膠成像分析儀中的配置
       資料顯示，國(guó)內(nèi)外凝膠成像分析系統(tǒng)廠家，在考馬斯亮藍(lán)染色、銀染等可見(jiàn)光凝膠成像分析應(yīng)用中檢測(cè)光源的配置問(wèn)題上，意見(jiàn)是不一致的。
       譬如Alpha公司的經(jīng)濟(jì)型凝膠成像系統(tǒng)AlphaImager EP，標(biāo)準(zhǔn)配置為反射白光雙側(cè)白光燈（Epi white lights），透射白光板作為選配件。而經(jīng)典型AlphaImager HP凝膠成像分析儀、AlphaImager FluorChem HD2 WB成像分析系統(tǒng)、FluorChem MWestern Blot印跡膜多色熒光成像系統(tǒng)，則同時(shí)將雙側(cè)反射白光光源和透射白光板（white light table）作為系統(tǒng)標(biāo)配。
        UVP公司BioDoc-It 2 Imaging Systems普及型凝膠成像儀標(biāo)配雙側(cè)反射白光光源，透射白光板（White Light Plate）為選配件。高端BioSpectrum Imaging System凝膠成像分析系統(tǒng)，則兼有反射型白光照明（Epi Illumination）、LED白光透射儀（LED White Light Illuminator）兩種白光光源。
       伯樂(lè)經(jīng)典Gel Doc XR+ 凝膠成像分析系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)白光光源包含透射白光板（White Light Transilluminator）和反射白光照明（epi-white illumination）。而GelDoc Go凝膠成像儀提供反射白光（Epi-white）做基礎(chǔ)白光光源，把紫外轉(zhuǎn)換型透射白光樣品盤（optional white tray）作視為非必需件。
       標(biāo)準(zhǔn)配置只提供雙側(cè)LED 白光反射燈的現(xiàn)象，在進(jìn)口Axygen GD-1000/GDBL-1000凝膠成像分析儀、國(guó)產(chǎn)勤翔GenoSens 2000系列凝膠成像分析儀、天能Tanon 1600凝膠成像儀上都可被觀察到。

       通常認(rèn)為，雙側(cè)LED 白光反射燈在凝膠成像中主要用于考染、銀染等蛋白質(zhì)電泳膠的觀察和拍攝；此外，在上樣時(shí)作為照明調(diào)整樣品位置以及鏡頭的精確對(duì)焦。
      而亮考染色、銀染蛋白質(zhì)電泳凝膠觀測(cè)的功能，與透射型白光光源作用是一致的。
      既然反射白光就能滿足蛋白凝膠可見(jiàn)光成像需要，為何不計(jì)成本、多此一舉，還要開(kāi)發(fā)透射型白光板？到底反射白光與透射白光作為檢測(cè)光源應(yīng)用上有何本質(zhì)區(qū)別？
      在回答前，先看看圖像分析領(lǐng)域的權(quán)威軟件關(guān)于反射和透射光源在圖像量化分析中應(yīng)用要求。

二、ImageJ軟件用戶指南關(guān)于反射和透射光源在圖像量化分析中應(yīng)用要求
      在ImageJ軟件用戶指南的《XXIV Using Scanners in Densitometry》附錄說(shuō)明中有如下內(nèi)容。
    【Electrophoretic gels such as Western blots need frequently to be quantified in order to translate biochemical results into statistical values. Independently of the measurement method, you should be familiar with the Beer–Lambert law, so that you are aware that the optical density (absorbance) of the staining to be measured must be proportional to the concentration of the probed material.】

    【Samples must be scanned in transmission mode.】

    【Scanners can only serve as densitometers if the light source and detector are on opposite sides of the instrument (transmission mode). This is critical for quantitation of absorbances and requires an adapter for transparencies or negatives to be mounted or built-in on the scanner.】

    【Most flatbed scanners have the light source and detector located on the same side of the instrument (reflection mode). Under these conditions, light interacts with semi-transparent objects in a complex manner with reflected light re-passing through the object on its way to the detector.In addition, thick samples (such as Coomassie-stained gels) are imaged from the surface under reflection light.】

      概括起來(lái)，可以這樣解讀：
      1）常規(guī)染色后核酸蛋白質(zhì)電泳凝膠圖像量化統(tǒng)計(jì)分析，前提須是條帶染色后的光密度（吸光度）大小與被檢測(cè)樣品的濃度成正比。這樣才符合Beer–Lambert定律；
      2）樣品必須以透射光模式進(jìn)行掃描
      只有當(dāng)檢測(cè)光源和光信號(hào)探測(cè)器位于被檢測(cè)樣品的兩側(cè)，光線直射穿透樣品后進(jìn)入掃描儀探測(cè)器獲得的圖像，才能作為樣品光密度的量化依據(jù)。這對(duì)于吸光度檢測(cè)至關(guān)重要。
      3）反射式檢測(cè)光源不符合Beer–Lambert定律應(yīng)用要求
      大多數(shù)平板掃描儀，由于光源和探測(cè)器位于被檢測(cè)樣品的同側(cè)，屬于反射模式掃描。
      在反射條件下，光以復(fù)雜方式與半透明的物體相互作用，經(jīng)歷多次反射、透射后進(jìn)入探測(cè)器，檢測(cè)器接收的反射光信號(hào)成份十分復(fù)雜?？捡R斯亮藍(lán)染色蛋白凝膠等物品存在一定厚度且對(duì)光通透，而凝膠表面會(huì)反射檢測(cè)光線。垂直射向凝膠檢測(cè)光線會(huì)有多次反射、透射，探測(cè)器采集的染色圖像不能真實(shí)代表凝膠樣品實(shí)際對(duì)透射光的吸收程度。因而，反射模式下樣品成像不可作為凝膠圖像和X-射線膠片量化分析的依據(jù)。
      我們把ImageJ圖像分析軟件指南中的規(guī)則應(yīng)用于凝膠成像分析系統(tǒng)中，得出如下推論。
      A）雙側(cè)反射白光，只能為亮考染色凝膠觀察與拍攝提供基礎(chǔ)照明作用，但反射光呈現(xiàn)的圖像染色深淺與凝膠中樣品實(shí)際含量并無(wú)直接關(guān)聯(lián)。基于反射光成像獲取的凝膠圖像，不可作為樣品中蛋白定量的依據(jù)。
      B）按照Beer–Lambert定律，檢測(cè)光線須是直射穿透檢測(cè)樣品，入射光線力求平行而均勻。如需基于樣品圖像進(jìn)行樣品含量量化分析，只能采用透射模式下采集的圖像。
      因此，對(duì)于根據(jù)染色來(lái)評(píng)估蛋白表達(dá)峰度的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，透射白光光源的配置是必要和科學(xué)的。譬如，在蛋白組學(xué)雙向電泳實(shí)驗(yàn)中，2D凝膠的透射掃描就是不可或缺的環(huán)節(jié)。
      當(dāng)然，凝膠光密度分析結(jié)果特異性，相對(duì)于Western Blot實(shí)驗(yàn)借助于蛋白印跡免疫檢測(cè)技術(shù)，的確不可同日而語(yǔ)。
      C）凝膠成像分析系統(tǒng)配置的透射型白光光源，除了可用于蛋白凝膠的成像定量分析，還可用作X線檢測(cè)底片的掃描成像，如臨床醫(yī)學(xué)X線、CT和MRI體檢底片，Western Blot實(shí)驗(yàn)采用放射線自顯影檢測(cè)技術(shù)獲得底片等影像資料。

三、小結(jié)
      總結(jié)起來(lái)：凝膠成像分析系統(tǒng)標(biāo)配反射白光光源是實(shí)用的；如需對(duì)凝膠染色后定量分析，或需對(duì)包括采用放射自顯影路線獲取WB實(shí)驗(yàn)檢測(cè)底片等X射線影像資料進(jìn)行量化分析，配置透射型白光光源具有重要使用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)
［1］FluorChem HD2 and FC2 User Guide，Revision 2（P/N 94-15068-00）
［2］BioSpectrum Imaging System Instruction Guide 81-0207-01 (Rev. O)
［3］ImageJ User Guide_IJ 1.46R