悟凝膠成像系統(tǒng)性能為圖像分析開新局-2

凝膠成像分析儀的CCD/CMOS傳感器，尺寸以1/2、3/4和1英寸多見。這里的尺寸是指CCD感光靶面的對(duì)角線長(zhǎng)度。但與電腦和手機(jī)屏幕尺寸用的單位英寸(inch)不同，CCD行業(yè)換算標(biāo)準(zhǔn)為1英寸為16mm而非25.4mm。常用的3/4英寸CCD對(duì)角線折合約12mm，外觀大小跟手指甲蓋面積相仿。

無(wú)論Wide Mini-Sub GT寬式水平電泳槽 灌制的7×7cm核酸凝膠，或伯樂Mini-Protean Tetra蛋白垂直電泳槽用的10.1×7.3cm小型SDS-PAGE蛋白凝膠，尺寸都遠(yuǎn)超傳感器感光面有效尺寸。更不用說(shuō)凝膠成像分析儀可容納1-4塊7×7cm或7×10cm小型凝膠同時(shí)成像，成像區(qū)域?qū)?0-26 cm×縱深14-22cm，物像尺寸比高達(dá)30-40倍。

孫悟空憑神乎其技的縮骨換形本事，才能鉆進(jìn)鐵扇公主的肚子里完成“說(shuō)走就走的旅行“。CCD要采集完整樣品區(qū)圖像，得靠光學(xué)鏡頭高效收集、匯聚來(lái)自拍攝對(duì)象的光線，形成清晰的縮小實(shí)像并精準(zhǔn)投射在感光靶面上，才居高臨下“一覽眾山小“。

光學(xué)鏡頭不僅對(duì)CCD成像效果發(fā)揮基礎(chǔ)決定作用，還對(duì)凝膠成像分析儀的機(jī)箱內(nèi)部空間高度有密切關(guān)系。

1、鏡頭的明眸善睞-光圈系數(shù)

數(shù)值孔徑是衡量光學(xué)鏡頭能收集光的角度范圍的指標(biāo)，等于透鏡與被檢物體間介質(zhì)折射率（n）和孔徑角（2θ）半數(shù)的正弦之積，即：NA = n × sinθ。

孔徑角是透鏡光軸上的物點(diǎn)與透鏡有效孔徑直徑(DEP)形成的夾角。孔徑角越大，鏡頭的光通量就越大。凝膠成像系統(tǒng)中，鏡頭數(shù)值孔徑NA =sinθ。如圖所示，NA與有效孔徑直徑(DEP) 或通光孔徑D成正比，與焦距成反比。

在攝影行業(yè)，通常都是用“光圈系數(shù)”（f-Stops/f-系數(shù)）” 表示鏡頭的通光能力大小。光圈系數(shù)f/#與NA為反比關(guān)系，即 NA=1/[2(f/#)]。f/#越小，則NA越大。

在鏡頭上標(biāo)記的數(shù)值f/1、f/1.4、f/2、f/2.8、f/4、f/5.6、f/8等，正是鏡頭的最大光圈系數(shù)f/#。鏡頭f/#越小，代表鏡頭通光孔徑越大，可采集到光線（通光量）越多，更容易發(fā)現(xiàn)弱信號(hào)樣品。

目前，普通凝膠成像儀用的鏡頭為f/1.2、f/0.95，而同時(shí)具有Western Blot印跡膜ECL成像與凝膠成像功能的成像系統(tǒng)，為增強(qiáng)檢測(cè)微弱信號(hào)檢測(cè)能力，鏡頭光圈系數(shù)為f/0.95 、f/0.8甚至更低。如Invitrogen iBright CL1500熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)為f/0.95，ChemiScope 6200熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為f/0.8。而GE最新的Amersham ImageQuant 800多功能成像儀搭載是f/0.74定焦鏡頭。

光圈系數(shù)不僅限于控制光通量，還與光學(xué)分辨率有關(guān)。f/#值越低，對(duì)細(xì)微結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)分辨和條帶邊緣輪廓細(xì)節(jié)呈現(xiàn)得越清晰。

考核和比較不同型號(hào)凝膠成像分析儀成像技術(shù)性能，可先從攝像鏡頭f/#值開始。

2、鏡頭的縮放自如-焦距

2.1鏡頭變焦 VS 定角

關(guān)于成像鏡頭焦距類型對(duì)曝光速度的影響問(wèn)題，Alapha官方資料中提到：對(duì)Western/Slot Blot樣品成像，F(xiàn)luorChem HD2 成像系統(tǒng)使用超級(jí)定焦鏡頭（Manual 50mm, f/0.95 fixed lens）來(lái)增加光信號(hào)收集速度，縮短成像時(shí)間；在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中，用變焦鏡頭的系統(tǒng)往往需要更多曝光時(shí)間才能得到合適的圖像。

這里提出2個(gè)論點(diǎn)，一是光學(xué)鏡頭有定焦鏡頭（fixed lens）和變焦鏡頭（zoom lens）之分，二是定焦鏡頭曝光速度高于變焦鏡頭。我們不妨展開來(lái)探討一下。

定焦鏡頭只有一個(gè)固定焦距鏡頭，常規(guī)攝影中常用的有8mm，15mm，24mm，28mm，35mm，50mm等多種。所謂“對(duì)焦”和“調(diào)焦”，是指用鏡筒上對(duì)焦環(huán)細(xì)微調(diào)整鏡頭與感光元件間成像距離，使拍攝成像清晰。

定焦鏡頭因?yàn)閮?nèi)部結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，鏡頭口徑往可以做得更大，數(shù)值孔徑NA增大（光圈系數(shù)較?。┖?，鏡頭光通量自然更大?！翱扃R頭”光圈很大，指的正是定焦鏡頭。

變焦鏡頭是在一定范圍內(nèi)可以變換焦距的鏡頭，通常是由很多個(gè)定焦鏡片排列組合而組成復(fù)雜結(jié)構(gòu)，如28～200mm鏡頭就集廣角、標(biāo)準(zhǔn)和中、長(zhǎng)焦距為一體，包含了6-7個(gè)定焦鏡頭?？赏ㄟ^(guò)旋轉(zhuǎn)鏡頭筒上的變焦環(huán)調(diào)節(jié)鏡片內(nèi)部之間距離，以保證不同遠(yuǎn)近對(duì)象都能形成清晰影像，復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)制約了鏡頭總體數(shù)值孔徑的提升，光通量提升空間極為有限。

由此，我們就容易理解所謂的定焦鏡頭“快”和“曝光時(shí)間短”的涵義了。

表1  凝膠成像系統(tǒng)鏡頭分辨率-焦距-成像區(qū)域指標(biāo)對(duì)比

從表1，我們可更直觀地看出定焦鏡頭和變焦鏡頭應(yīng)用的區(qū)別。凝膠成像分析儀用的是光圈系數(shù)f/1.2的8-48mm變焦鏡頭。而具有Western Blot化學(xué)發(fā)光成像功能的Invitrogen iBright CL1000印跡膜與凝膠多功能成像系統(tǒng)，用的則是25mm固定焦距光圈系數(shù)f-0.95的鏡頭，其目的就是為了“快”。

2.2 鏡頭焦距與成像大小

凝膠成像分析系統(tǒng)可檢測(cè)樣品呈多元化，不同樣品和不同操作習(xí)慣，樣品托盤不同，物品與鏡頭距離存在區(qū)別。

根據(jù)透鏡成像公式，焦距確定后，選定拍攝對(duì)象即確定了物距，此時(shí)通過(guò)對(duì)焦環(huán)調(diào)整透鏡和感光元件間距可確保成像清晰。這個(gè)過(guò)程稱為對(duì)焦(focus)?？捎墒謩?dòng)完成（“手動(dòng)對(duì)焦”），也可以是相機(jī)自動(dòng)完成（“自動(dòng)對(duì)焦”）。

譬如，同一塊EB染色瓊脂糖DNA凝膠，可直接置于紫外臺(tái)上，也可裝于凝膠托盤再轉(zhuǎn)移至紫外透射臺(tái)觀察；紫外透射臺(tái)疊加藍(lán)光轉(zhuǎn)換板用于SYBR Safe凝膠觀察；紫外臺(tái)上添加白光轉(zhuǎn)換板，可用于考馬斯亮藍(lán)蛋白凝膠檢測(cè)。不同操作習(xí)慣和不同應(yīng)用，會(huì)造成物距不同，無(wú)論對(duì)定焦還是變焦鏡頭，都需通過(guò)鏡頭對(duì)焦環(huán)微調(diào)像距，以確保圖像清晰。

物距U減少，對(duì)于固定焦距鏡頭，像距V增加，結(jié)果是圖像與拍攝對(duì)象比例增加，即圖像得到放大。但因像距存在f < v <2f限制，故鏡頭上下可調(diào)范圍小于1f。因此，短焦距定焦鏡頭，對(duì)焦只能解決圖像質(zhì)量問(wèn)題，圖像光學(xué)放大能力極為有限。

要放大圖像需加大焦距。對(duì)同一距離同一個(gè)目標(biāo)拍攝，短焦距鏡頭所得圖像?。ǔ上褚曇按螅?，長(zhǎng)焦距鏡頭所得圖像大（成像視野小）。變焦鏡頭通過(guò)調(diào)節(jié)鏡頭的焦距來(lái)采集不同大小的影像和不同取景范圍。譬如先用18mm焦距拍攝得凝膠成像儀整個(gè)成像區(qū)域全貌預(yù)覽，再調(diào)整為50mm焦距拍照，但拍攝樣品圖像得到放大。這個(gè)功能稱為縮放圖像功能（Zoom）。

2.3 Zoom功能的應(yīng)用價(jià)值

用凝膠成像分析儀采集實(shí)驗(yàn)圖像目的無(wú)非是用于圖像調(diào)整處理分析和發(fā)文審核。目前SCI期刊插圖排版分為半版(8.0cm)，2/3版(14cm)和整版(17cm)三種形式。

根據(jù)人體工程學(xué)原理，如使用18.5英寸顯示器臺(tái)式機(jī)或14英寸筆記本屏幕的水平×垂直分辨率為1366×768像素(1920×1080像素)，無(wú)論是提審還是在線瀏覽，計(jì)算表明：半版圖水平分辨率達(dá)到384像素(560像素)，且垂直分辨率不高于618像素(869像素)時(shí)（否則圖像會(huì)被按比例縮小顯示)，視覺體驗(yàn)最佳。最大成像區(qū)21×16.8cm的凝膠成像儀生成可供發(fā)表的8.0cm圖像，CCD分辨率應(yīng)不低于1.36 MP，否則實(shí)施數(shù)碼放大后，圖像美感要大打折扣。

有網(wǎng)友認(rèn)為，發(fā)表JPG/TIFF圖片分辨率不低于300dpi以400-500dpi為宜。這顯然是把打印機(jī)的Dot和電腦顯示的像素(Pixel)混為一談，但也說(shuō)明發(fā)表圖像分辨率確應(yīng)從源頭上引起重視。

阿拉斯加科技近期完成了一項(xiàng)的專題調(diào)研，意在統(tǒng)計(jì)2016年1月-2021年1月發(fā)表的采用電泳凝膠圖像數(shù)據(jù)的SCI期刊論文情況。結(jié)果顯示Science、Cells、Nucleic Acids Res、PANS、Genetics、J Biol Chem、Pharmaceutical Biology等都有相關(guān)文章。

2016.01-2021.01 SCI論文電泳凝膠圖像應(yīng)用舉例

調(diào)研還發(fā)現(xiàn)，文中明確所用的凝膠成像分析儀中，有GelDoc XR 2篇、AlphaImager EP、AlphaImager HP各1篇。這幾款面世超10年的機(jī)型，CCD分辨率均剛達(dá)到136萬(wàn)像素標(biāo)準(zhǔn)，離268萬(wàn)像素的要求尚有差距。

這種情況，Zoom是解決圖像分辨率不足的最有效辦法。將凝膠或培養(yǎng)皿在樣品臺(tái)居中后，啟用Zoom控制調(diào)整鏡頭焦距，讓圖像盡量充滿預(yù)覽框，再聚焦和采集圖像，圖像分辨率將提升近140萬(wàn)像素，無(wú)論是提交審稿還是在線瀏覽，原圖放大也不再難堪。

參考文獻(xiàn)：

1. GelDoc XR and ChemiDoc XRS+ Imaging System Instruction Guide Version 6.0

2. GelDoc Go Imaging System with Image Lab Touch Software User Guide（10000125685）

3.  Proteinsimple Alpha FluorChem HD2化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)彩頁(yè)