光學(xué)對比法使人們有可能借助生物顯微鏡輕松檢查活的和無色的標(biāo)本。不同的顯微技術(shù)旨在將由光與樣品的相互作用引起的相移改變?yōu)檎穹兓?，人眼可以看到振幅變化?/span>

明場顯微鏡通常只能提供未染色標(biāo)本的較弱圖像，其中只有少量細(xì)節(jié)可以檢測到。強(qiáng)烈的對比度對于查看圖片中的更多細(xì)節(jié)很重要。增強(qiáng)對比度的一種方法是對樣品染色。但是，由于這對于活生物體來說是不可能的，因此它們保持不變色并且顯得不起眼。這些樣本實際上也在光學(xué)顯微鏡中與入射光相互作用。然而，發(fā)生了人眼無法檢測到的相移。眼睛只能感覺到振幅（亮度）和頻率（顏色）的變化。

 對比度是指區(qū)分樣本和背景并發(fā)現(xiàn)樣本中細(xì)節(jié)的可能性。定義為圖像與相鄰背景之間的光強(qiáng)度與總背景強(qiáng)度的差。對于人眼，這些差異必須至少為百分之二才能被檢測到。使用光電探測器可以實現(xiàn)巨大的改進(jìn)。

 但是，對比度不僅取決于樣品及其與光本身的相互作用。用于觀察標(biāo)本的光學(xué)系統(tǒng)及其記錄圖像信息的能力也很關(guān)鍵。在顯微系統(tǒng)中，對比度取決于正確的光圈設(shè)置，光學(xué)像差的等級，所使用的對比度方法，樣本和檢測器。

 因此，通過改變光圈的光圈設(shè)置，可以獨立于對比度方法而影響用光學(xué)顯微鏡獲取的圖像的對比度。但是，例如如果聚光鏡停止得太遠(yuǎn)，則分辨率會受損，并且可能會出現(xiàn)衍射偽像。

 獲得足夠?qū)Ρ榷鹊淖罟爬戏椒赡苁窍葘悠啡旧?。通常，這僅適用于死物質(zhì)，并偶爾需要一些復(fù)雜的染色方案。如果要觀察活細(xì)胞，則不容易染色。因此，由適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)顯微鏡提供的不同技術(shù)旨在將由光與樣本的相互作用引起的相移改變?yōu)榉绕啤?/span>

 相位對比和微分干涉對比（DIC）是這些對比方法的示例。其他光學(xué)對比方法是暗場和偏振對比。

兔子味蕾斷面，相差顯微鏡

兔子味蕾斷面，微分干涉對比顯微鏡

兔子味蕾斷面，明場顯微鏡

光線與標(biāo)本之間的相互作用

如果入射光照射到標(biāo)本上，它們將相互作用。吸收，反射，衍射，光散射和折射都是可能的后果。在此過程中，醒目的光波發(fā)生了變化。相移以及幅度變化都是可能的。

 在這一方面，可以區(qū)分相位和幅度對象。理想地描述，相位對象是改變相位但不改變光波幅度的樣本。相反，振幅對象僅影響光的振幅，而不影響光的相位。扁平且未染色的細(xì)胞幾乎達(dá)到了可見光相位對象的特性。由于它們僅導(dǎo)致人眼無法看到的相移，因此它們在明場顯微鏡下的對比度非常低。振幅對象本身可以在明場顯微鏡中很好地成像。它們降低了振幅，從而降低了穿過的光的強(qiáng)度。

 染色或自然著色的物體可以在明亮的視野中很好地顯示。它們屬于振幅對象。它們減少了通過的光，因此減小了波前的幅度。但是它們不是理想的振幅對象。除了振幅外，它們還影響照射光的成分。它們吸收或反射具有不同頻率的波，而其他波長的光可以不受阻礙地穿過。

 由于樣品和周圍介質(zhì)的折射率不同，會發(fā)生相移。如果光波進(jìn)入單元，它將被準(zhǔn)減速，而振幅將保持不變。當(dāng)光離開細(xì)胞時，它恢復(fù)速度并以與以前相同的頻率，波長和幅度穿過介質(zhì)。然而，與僅穿過介質(zhì)的光相比，其相位已經(jīng)發(fā)生了變化。

 鑒于人眼和其他光學(xué)檢測器無法識別和檢測光波的相移，在未染色和未著色樣品的情況下，對比方法的主要目的是產(chǎn)生振幅對比并將相位對比轉(zhuǎn)換為幅度對比。

對生物學(xué)研究的巨大影響

與使用固定和沾染的物體相比，使用未染色的標(biāo)本具有許多優(yōu)勢。它允許在沒有固定物和染色偽影的生物顯微鏡下觀察活體。固定和染色會例如使樣品收縮或膨脹。此外，存在破壞細(xì)胞中不同結(jié)構(gòu)或?qū)嵸|(zhì)上改變其形態(tài)的風(fēng)險。消除這種危險的唯一肯定的方法是使用沒有偽影并提供可靠和真實信息的活體樣品。活細(xì)胞顯微鏡檢查的另一個巨大優(yōu)勢是可以檢查與時間有關(guān)的情況。除了獲得細(xì)胞的靜態(tài)信息及其狀況的快照之外，還可以輕松監(jiān)控整個過程，例如細(xì)胞運動，細(xì)胞分裂以及細(xì)胞凋亡。

 從不同的光學(xué)對比方法獲得的信息和印象取決于其來源。因此，建議依靠不同對比技術(shù)的組合來獲得所檢查樣本的最準(zhǔn)確和最詳細(xì)的圖像。盡管明場通常無法準(zhǔn)確觀察細(xì)胞的形態(tài)，但其他光學(xué)對比方法可能會提供進(jìn)一步的見解。

 通過將熒光標(biāo)記添加到細(xì)胞的實時圖像中可以獲得更多信息?？梢杂脽晒獾鞍祝ㄈ鏕FP）標(biāo)記細(xì)胞中感興趣的蛋白。然后可以通過光學(xué)顯微圖像追蹤并精確確定其在細(xì)胞內(nèi)部的定位。也存在將GFP與肽定位信號偶聯(lián)的可能性。這樣，可以看到像內(nèi)質(zhì)網(wǎng)這樣的不同隔室。

 用于研究的現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡通常采用模塊化設(shè)計，從而可以在各個對比方法之間或什至同時應(yīng)用時快速切換。光學(xué)對比方法使人們有可能在日常的實驗室常規(guī)操作中輕松檢查活的和無色的標(biāo)本。