悟凝膠成像系統(tǒng)性能為圖像分析開(kāi)新局-1

      從本篇開(kāi)始，我們開(kāi)啟《悟凝膠成像系統(tǒng)性能為圖像分析開(kāi)新局》系列專題，通過(guò)總結(jié)分析凝膠成像分析儀各組成模塊的現(xiàn)狀和演變，以便全面有效評(píng)價(jià)凝膠成像分析儀的技術(shù)性能。同時(shí)，嘗試進(jìn)一步發(fā)掘凝膠成像儀的功能應(yīng)用，讓這款經(jīng)典儀器為實(shí)驗(yàn)樣品圖像分析開(kāi)創(chuàng)新局面。
      凝膠成像分析儀，是集凝膠成像暗箱、檢測(cè)光學(xué)組件、圖像采集單元、電腦操作控制單元等硬件模塊于一體，在圖像采集和分析軟件控制下，采集核酸蛋白電泳凝膠、細(xì)菌培養(yǎng)皿、多孔板等多種實(shí)驗(yàn)載體樣品的圖像，并可調(diào)用隨機(jī)軟件相應(yīng)功能插件對(duì)圖像進(jìn)行定量、半定量分析的綜合軟硬件復(fù)合系統(tǒng)。
      因此，凝膠成像分析儀又常被稱作凝膠圖像分析系統(tǒng)（Gel Documentation Systems）。如Axygen的GD-1000 Gel Documentation Systems，伯樂(lè)的 GelDoc Go Gel Imaging System，賽默飛E Gel Imager Gel Documentation System及國(guó)產(chǎn)勤翔公司GenoSens 2000凝膠成像分析系統(tǒng)等等。
      凝膠圖像分析前提是圖像的數(shù)字化。
      所謂數(shù)字化圖像（Digital Images）是用沿著x軸（行）方向和 y軸方向（列）方向排列若干正方形像素/像元（Pixels/picture elements）定義圖像寬度、高度和每個(gè)位置像素強(qiáng)度值的二維網(wǎng)格像素陣列（two-dimensional grids of pixel intensities values）。
      數(shù)字化圖像生成離不開(kāi)CCD和CMOS這兩個(gè)常用的圖像傳感器。傳感器由數(shù)十至數(shù)百萬(wàn)個(gè)具有光電轉(zhuǎn)換和電荷存儲(chǔ)功能的像素組成。它利用感光二極管將每個(gè)像素收集的光子通過(guò)光電轉(zhuǎn)換累積儲(chǔ)存電荷，再經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換器ADC將電信號(hào)轉(zhuǎn)換為圖像的數(shù)字信號(hào)后壓縮保存或傳輸?shù)接?jì)算機(jī)存儲(chǔ)分析。

      正是基于CCD在圖像快速捕獲與存儲(chǔ)中的核心地位，考核評(píng)價(jià)凝膠成像分析系統(tǒng)的性能，通?？蓮膶徱旵CD的技術(shù)性能開(kāi)始。

一、衡量CCD技術(shù)性能的基本要素

1.1 CCD像素?cái)?shù)量

      數(shù)字相機(jī)的傳感器由數(shù)十萬(wàn)至幾千萬(wàn)個(gè)像素呈棋盤(pán)狀排列組成。相機(jī)的分辨率是指CCD或CMOS成像傳感器所采集到的單個(gè)水平像素（M）與垂直像素（N）的數(shù)量總和。傳感器的分辨率越高，成像后的圖像像素越高，圖像輪廓細(xì)節(jié)就越清晰。

      相機(jī)分辨率要根據(jù)需求而定，并非分辨率越高越好。高分辨率圖像的數(shù)據(jù)量大，聯(lián)機(jī)的圖像傳輸速度幀率(Frames Per Second，F(xiàn)PS)就迅速下降，圖像顯示動(dòng)作遲滯欠流暢。目前，與熒光顯微成像系統(tǒng)動(dòng)輒1000-2000萬(wàn)像素的成像單元比，市面主流凝膠成像系統(tǒng)還以300-600萬(wàn)像素CCD為主。

1.2 CCD像素尺寸

      CCD傳感器分辨率還受像素尺寸大小的制約。像素尺寸（像元尺寸）是指一個(gè)像素在長(zhǎng)和寬方向上所代表的實(shí)際大小，尺寸以2-20μm居多。圖像大小一定的情況下，像素尺寸越大，分辨率越低，圖像清晰度越低。像素尺寸小，相機(jī)的分辨率增加，有利于對(duì)細(xì)小缺陷的檢測(cè)和增大檢測(cè)視場(chǎng)。

      像素尺寸大小與圖像像素計(jì)算公式為：

      據(jù)此推導(dǎo)出以下公式：

      公式2說(shuō)明：圖像中一個(gè)像素點(diǎn)表示的實(shí)際距離 = 像元尺寸/放大倍數(shù)（備注：凝膠分析系統(tǒng)中CCD鏡頭常用的放大倍率有0.35X、0.5X、0.7X，實(shí)際是縮小圖像而非放大）。因此，像素尺寸7μm的相機(jī)對(duì)圖像分辨率不如4μm的相機(jī)。但不能據(jù)此認(rèn)為，像素尺寸越小越好，還應(yīng)根據(jù)樣品成像場(chǎng)景要求而定。

      相機(jī)的像素在曝光過(guò)程中吸收光子轉(zhuǎn)換為電子。感光區(qū)域越亮，收集到的光子越多，積累的電荷量也越大。沒(méi)有吸收光子和吸收光子至滿載的像素值分別顯示為"0"和"255"，即代表圖像純黑色和純白色。每個(gè)像素接受光信號(hào)的過(guò)程叫曝光，所花的時(shí)間叫曝光時(shí)間。

      CCD傳感器像素在受到強(qiáng)光照射時(shí)，亮點(diǎn)區(qū)域像元獲得的光照過(guò)強(qiáng)，光電二極管產(chǎn)生的光電子數(shù)超過(guò)CCD電荷容量而溢出，此時(shí)溢出的電子將沿行或列方向進(jìn)入相鄰像素，導(dǎo)致在過(guò)飽和的像素點(diǎn)附近錯(cuò)誤的像素信號(hào)值，被“污染”的相鄰圖像區(qū)域出現(xiàn)光暈（Blooming）效果。

      像素面積縮小，能儲(chǔ)存的電荷量隨之減小。一旦像素滿載便會(huì)溢出。高光溢出使鄰近像素發(fā)生“快速充電”，但其實(shí)并非因接收光子光電轉(zhuǎn)換的真實(shí)值。結(jié)果是，圖像高光區(qū)域部分的信息損失。若采用減少曝光時(shí)間來(lái)防止高光溢出的辦法，則會(huì)造成對(duì)應(yīng)于昏暗環(huán)境的像素曝光時(shí)間不夠，得到的像素值太低，這樣會(huì)導(dǎo)致圖像昏暗部分信息缺失。

      而大尺寸感光元件的像素電荷容量大，不易因延長(zhǎng)曝光時(shí)間而被“填滿”，因此，與昏暗環(huán)境對(duì)應(yīng)的像素在描繪明亮環(huán)境的像素“滿載”之前，有更多時(shí)間吸收光子，確保畫(huà)面明暗均衡，實(shí)現(xiàn)“淡妝濃抹總相宜”的美好境界。

1.3 CCD像素動(dòng)態(tài)范圍

      動(dòng)態(tài)范圍(Dynamic Range)是物理學(xué)中表示某一物理量最大值與最小值的比率，通常以對(duì)數(shù)表示，單位默認(rèn)情況下用分貝(dB)表示，也可以用比特(bit)或擋來(lái)表示。就CCD測(cè)量而言，動(dòng)態(tài)范圍通常是指CCD的最大信號(hào)電平與讀出噪聲電平之間的比值。

      對(duì)于真實(shí)場(chǎng)景，是指最亮處與最黑處的亮度之比。某一場(chǎng)景的動(dòng)態(tài)范圍很廣,就是說(shuō)場(chǎng)景中從陰影部分到高光部分之間的曝光數(shù)值相差很大。一般來(lái)說(shuō)，低動(dòng)態(tài)范圍的相機(jī)噪聲比較多，照片會(huì)缺失亮部細(xì)節(jié)和暗部細(xì)節(jié)。而寬動(dòng)態(tài)范圍有利于將場(chǎng)景中極亮和極暗部分細(xì)節(jié)同時(shí)被清晰地顯示，畫(huà)面的對(duì)比度高。

      當(dāng)拍攝不同應(yīng)用場(chǎng)景的圖像時(shí)，有兩個(gè)動(dòng)態(tài)范圍是需要考慮的：一是要拍攝場(chǎng)景的動(dòng)態(tài)范圍，二是相機(jī)的感光元件的動(dòng)態(tài)范圍。因此，應(yīng)盡可能地是相機(jī)的動(dòng)態(tài)范圍與應(yīng)用場(chǎng)景的動(dòng)態(tài)范圍匹配，以確保圖像的亮部細(xì)節(jié)和暗部細(xì)節(jié)都完美展現(xiàn)。

      小尺寸像素因光電溢出效應(yīng)，造成相機(jī)動(dòng)態(tài)范圍的降低。而大尺寸像素設(shè)計(jì)，使相機(jī)具有更大動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。

      芯片的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍擴(kuò)大，使成像系統(tǒng)可同時(shí)應(yīng)對(duì)微弱信號(hào)條帶、高亮度條帶的檢測(cè)能力得到質(zhì)的飛躍，特別有利于復(fù)雜的科研實(shí)驗(yàn)圖像分析。

      目前，芯片的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍從早起的1.8已擴(kuò)展到3.5-4.0個(gè)數(shù)量級(jí)。

1.4 CCD像素深度

      像素深度（Bit–Depth）是指相機(jī)存儲(chǔ)每個(gè)像素值（intensity of pixel）所用的Bit位數(shù)。它決定灰度圖像的每個(gè)像素可能有的灰度級(jí)數(shù)（gray levels）或者決定彩色圖像的每個(gè)像素可用的顏色數(shù)。每個(gè)像素的比特位數(shù)多，圖像顏色更接近實(shí)物本身。最常見(jiàn)的像素深度有1-bit、8-bit、16-bit、24-bit和32-bit。

      8-bit像素灰度圖像（gray image），從最暗黑色到最亮的白色，共有256級(jí)灰度可定義。如彩色圖像的R、G、B三個(gè)色彩分量用固定5-bit表示外加1位屬性(Attribute)位，則一個(gè)像素的深度為16-bit。如每個(gè)像素的R、G、B三個(gè)分量每個(gè)均為8-bit，則像素深度為24-bit，每個(gè)像素可代表224次方種顏色中的一種，對(duì)色彩的變現(xiàn)力將極大改善。

      通俗地講，像素深度代表的是相機(jī)圖像色調(diào)的再現(xiàn)表達(dá)能力。

二、凝膠成像分析系統(tǒng)CCD的技術(shù)迭代歷程

      縱觀近20年凝膠成像分析儀技術(shù)發(fā)展，顛覆性革新就發(fā)生在CCD成像單元。

      伯樂(lè)凝膠成像分析儀為例，抽取20年前-10年前-目前三個(gè)代表性機(jī)型，基于官方公開(kāi)發(fā)表技術(shù)資料，匯總了不同年代CCD主要性能指標(biāo)表。

表1  2000-2020年伯樂(lè)公司凝膠成像系統(tǒng)CCD主要性能指標(biāo)對(duì)比

      表1表明，20年間，隨著半導(dǎo)體和大規(guī)模集成電路設(shè)計(jì)制造工藝進(jìn)步，CCD的像素尺寸經(jīng)歷了9.8μm、4.65μm、2.4μm瘦身過(guò)程。成倍縮小的像素使得在相同尺寸芯片集成更多像素稱為可能，推動(dòng)著凝膠成像分析儀的CCD像素?cái)?shù)量一路高歌猛進(jìn)，從20年前40萬(wàn)像素升至130萬(wàn)像素，又再?gòu)?00萬(wàn)像素飆升到目前的630萬(wàn)像素。

      近年上市的美國(guó)賽默飛Invitrogen iBright CL750 Western blot凝膠成像分析系統(tǒng) 的CCD圖像分辨率更是高達(dá)910萬(wàn)像素（3380×2704 pixels,像素尺寸2.69μm×2.69μm)。

      CCD像素的增加不僅使圖像輪廓細(xì)節(jié)刻畫(huà)得更細(xì)膩，在對(duì)選區(qū)的定量分析中，有助于提高選區(qū)面積和區(qū)內(nèi)像素強(qiáng)度值的計(jì)算精準(zhǔn)性。

      CCD動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍的擴(kuò)大不僅有利于不同部位光線強(qiáng)弱懸殊的樣品圖像的完美兼容，還擴(kuò)大了對(duì)不同類型屬性樣品的檢測(cè)適用范圍。

      CCD像素深度的演變，提高了CCD檢測(cè)靈敏度，使不同條帶量化數(shù)值更精確。16-bit像素深度計(jì)算處理能力，使圖像從黑白的混沌豁然迎來(lái)五彩斑斕的境地。

參考文獻(xiàn)：

1. Bio-Rad Quantity One Version 4.4 User Guide RevA (4000126-14)

2. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)