讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-5

      《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》提出，用ImageJ圖像分析軟件對(duì)Western Blot條帶定量分析中，背景扣除用的滾球半徑值設(shè)置的科學(xué)合理對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生重要影響。而半徑設(shè)置應(yīng)根據(jù)被分析對(duì)象在圖像中的范圍尺寸進(jìn)行。

       本文從Western Blot條帶圖像信號(hào)分布的固有特征出發(fā)，來(lái)探討基于條帶短軸方向像素強(qiáng)度分布范圍大小來(lái)確定Rolling ball半徑方法的理論依據(jù)和在WB條帶定量分析中應(yīng)用可行性。

一、Westen Blot條帶圖像信號(hào)分布范圍決定著條帶強(qiáng)度分析結(jié)果

1.1 Western Blot實(shí)驗(yàn)條帶的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度較穩(wěn)定
       Western Blot實(shí)驗(yàn)操作繁瑣且環(huán)節(jié)眾多，極大影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

       眾所周知，實(shí)驗(yàn)條件（Buffer配方、工作溫度及pH值等）、試劑耗材品質(zhì)和具體操作細(xì)節(jié)上的人為差異，以及蛋白分子自身水溶性、等電點(diǎn)、分子量、表達(dá)水平等屬性存在區(qū)別，造成不同實(shí)驗(yàn)室間、不同實(shí)驗(yàn)批次間WB條帶圖像存在很大區(qū)別。

       如條件許可，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)硬件配置和自動(dòng)化程度，積極優(yōu)化操作流程，無(wú)疑有助于提高WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定和可靠性。譬如，如蛋白凝膠電泳用伯樂(lè)Mini-Protean Tetra蛋白垂直電泳槽，電泳梳統(tǒng)一為10孔10.mm或15孔1.0mm（可穩(wěn)定電泳條帶形態(tài)長(zhǎng)度和蛋白初始載量）,轉(zhuǎn)膜就來(lái)Mini-Trans Blot小型電轉(zhuǎn)印槽或用帶內(nèi)置程序的Trans-Blot Turbo蛋白快速轉(zhuǎn)印儀（穩(wěn)定轉(zhuǎn)膜條件和效果），抗原抗體免疫雜交按Merck Western Blotting檢測(cè)加速器SNAP i.d. 2.0等預(yù)置程序進(jìn)行（穩(wěn)定檢測(cè)條件和效果）,曝光成像統(tǒng)一為CCD分辨率910萬(wàn)像素的英捷iBright CL系列化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)或630萬(wàn)像素的伯樂(lè)ChemiDoc Western ECL化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)，采用優(yōu)化的曝光設(shè)置（確保檢測(cè)靈敏度、圖像分辨率與條帶尺寸一致）等。

       Western Blot實(shí)驗(yàn)采用相同實(shí)驗(yàn)條件和流程，排除轉(zhuǎn)印等操作失誤因素后，同一批次實(shí)驗(yàn)，10孔SDS-PAGE凝膠獲得的Blot，條帶長(zhǎng)度差異不過(guò)1～4個(gè)像素。
       實(shí)測(cè)經(jīng)驗(yàn)表明，條帶分析選區(qū)的長(zhǎng)軸適度延長(zhǎng)1-3個(gè)像素，對(duì)ROI面積和IntDen值影響忒微。條帶長(zhǎng)軸長(zhǎng)度并非Western Blot條帶測(cè)試值的關(guān)鍵影響因素。

1.2 Western Blot實(shí)驗(yàn)條帶的短軸方向分布具有條帶特異性
       通常情況下，Western Blot實(shí)驗(yàn)圖像上，條帶亮度強(qiáng)度分布規(guī)律是從條帶長(zhǎng)軸中心順著短軸一前、一后兩個(gè)方向擴(kuò)散分布并漸次減弱，直至淹沒(méi)于條帶背景中。

       經(jīng)驗(yàn)告訴我們，條帶寬度，會(huì)因蛋白表達(dá)豐度而存在顯著區(qū)別。一般說(shuō)來(lái)，電泳蛋白初始載量大，對(duì)應(yīng)條帶圖像不僅亮度高，條帶也寬。反之，圖像中弱信號(hào)條帶，往往伴隨條帶寬度的明顯縮窄。

       為Western Blot圖像條帶創(chuàng)建分析選區(qū)中可發(fā)現(xiàn)，各條在帶短軸方向強(qiáng)度信號(hào)分布范圍的哪怕僅1個(gè)像素列的差別，會(huì)使ROI選區(qū)的像素?cái)?shù)量（Area值）以數(shù)十的幅度猛增，而IntDen值則以千量級(jí)急劇放大。這就很好地解釋了，肉眼看似條帶差別不大，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異懸殊的常見(jiàn)現(xiàn)象。
       可見(jiàn)，條帶短軸長(zhǎng)度與ROI的Area值和IntDen值均存在顯著正向關(guān)聯(lián)。
       說(shuō)明，是Westen Blot條帶短軸方向圖像強(qiáng)度信號(hào)分布范圍大小，左右著條帶統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。   

       故應(yīng)遵循電泳實(shí)驗(yàn)客觀規(guī)律，抓準(zhǔn)真正影響分析結(jié)果的牛鼻子。

       根據(jù)《為Western Blot條帶分析背景扣除牛轉(zhuǎn)乾坤的Rolling ball》的觀點(diǎn)，Western Blot圖像條帶分析選區(qū)的背景扣除算法中Rolling ball滾球半徑值，應(yīng)當(dāng)按照分析對(duì)象在圖像中的分布范圍大小來(lái)確定。

      顯然，條帶圖像強(qiáng)度信號(hào)在短軸方向的分布范圍，正是Rolling ball滾球半徑值設(shè)定的首選參考標(biāo)準(zhǔn)。

二、基于條帶短軸信號(hào)分布范圍建立條帶分析選區(qū)方法的實(shí)測(cè)驗(yàn)證

       實(shí)測(cè)目的是嘗試解決以下三個(gè)問(wèn)題：

       90°旋轉(zhuǎn)后，是否會(huì)影響圖像ROI的IntDen值？

       分別依照條帶短軸和長(zhǎng)軸模式創(chuàng)建ROI，分析結(jié)果是否存在差異？

       按短軸模式建立的ROI背景扣除設(shè)置是否可以移植到傳統(tǒng)長(zhǎng)軸分析模式中？

2.1 圖片來(lái)源

       2020年發(fā)表于NATURE COMMUNICATIONS的ARTICLE《CLR01 protects dopaminergic neurons in vitro and in mouse models of Parkinson’s disease》中PGC1α的Western blotting實(shí)驗(yàn)圖像，保存為.bmp格式。

2.2 圖像處理準(zhǔn)備

      1）通過(guò)反相處理，所得圖像為條帶長(zhǎng)軸分析模式；

      2）反相后再進(jìn)一步旋轉(zhuǎn)90°處理后用作條帶短軸分析模式；

      兩幅處理后生成的新圖分別保存為.tif格式備用。

2.3 圖像ROI創(chuàng)建

      按《如何用ImageJ在Western Blot條帶定量分析中創(chuàng)建分析選區(qū)》所述方法，依次實(shí)施條帶ROI邊界評(píng)估→創(chuàng)建ROI→保存ROI方案操作。

      本次在條帶長(zhǎng)軸、短軸兩種分析模式下創(chuàng)建的兩個(gè)ROI設(shè)置和分析條件見(jiàn)表1。

表1  條帶長(zhǎng)軸、短軸分析模式建立的ROI情況

2.4 ImageJ的Plot Profile分析

      依據(jù)條帶短軸和長(zhǎng)軸分析模式建立的兩個(gè)ROI，實(shí)際是位置、大小完全的同一個(gè)選區(qū)。在同一個(gè)分析界面分別執(zhí)行Measure→Plot profile，結(jié)果如fig. 4所示。

      Plot分析顯示，采用短軸模式ROI的條帶強(qiáng)度值分布呈現(xiàn)近似于高斯模型，灰度值范圍為93-122。而長(zhǎng)軸模式ROI強(qiáng)度值為不規(guī)則峰形，灰度值范圍為88-114。

2.5 軟件分析結(jié)果

      兩個(gè)模式創(chuàng)建的ROI，分別執(zhí)行Measure命令后，在同一個(gè)分析界面顯示的IntDen值完全一致。提示，用ImageJ將圖像旋轉(zhuǎn)90°處理，相同ROI，IntDen信號(hào)值未見(jiàn)顯著變化。

      將長(zhǎng)軸與短軸兩種分析模式的ROI，分別扣除背景后，執(zhí)行measure命令后，結(jié)果如fig. 6所示。

      結(jié)果表明，兩種模式的ROI，采用不同背景校正設(shè)置后，IntDen有效計(jì)算值相差極為懸殊。短軸模式ROI IntDen值為42589，長(zhǎng)軸模式ROI IntDen值為48629.，前者僅后者的87.5%，差異顯著。

      對(duì)長(zhǎng)軸模式ROI分別采用長(zhǎng)軸模式、短軸模式、混合模式的背景扣除方法，進(jìn)一步對(duì)長(zhǎng)軸ROI分析，結(jié)果見(jiàn)fig. 7。

      結(jié)果顯示：

      1）長(zhǎng)軸模式ROI，用長(zhǎng)軸背景扣除法、短軸半徑+長(zhǎng)軸背景設(shè)置、短軸背景扣除法校正背景后，IntDen計(jì)算值分別為48629、10127、42589；

      2）長(zhǎng)軸ROI模式按照自身Plot分布形態(tài)設(shè)計(jì)的背景扣除設(shè)置方案，所得數(shù)據(jù)明顯大于短軸模式ROI測(cè)試值和在長(zhǎng)軸ROI上用短軸ROI分析模式背景扣除方案的結(jié)果；

      3）長(zhǎng)軸分析模式ROI，采用跟短軸分析模式完全一致的背景扣除設(shè)置，軟件計(jì)算結(jié)果完全等效于短軸分析模式所得結(jié)果。

2.6  驗(yàn)證結(jié)論

       基于條帶短軸信號(hào)分布創(chuàng)建分析選區(qū)ROI、計(jì)算ROI匹配的背景扣除滾球半徑，運(yùn)用于實(shí)例的檢驗(yàn)測(cè)試說(shuō)明：

       1）測(cè)試圖像經(jīng)90°旋轉(zhuǎn)處理，未對(duì)ROI分析值產(chǎn)生明顯影響；

       2）分別依照條帶短軸和長(zhǎng)軸模式創(chuàng)建的ROI分析數(shù)據(jù)差異明顯，無(wú)可比性；

       3）按照短軸模式設(shè)計(jì)的ROI背景扣除設(shè)置，可以移植到長(zhǎng)軸模式ROI。

       結(jié)果表明，原始圖像旋轉(zhuǎn)90°后，在條帶短軸模式下摸索出背景扣除設(shè)置方案，可直接照搬用于常規(guī)長(zhǎng)軸模式下創(chuàng)建的ROI分析。

三、討論

      無(wú)論是實(shí)驗(yàn)技術(shù)網(wǎng)絡(luò)論壇，還是期刊論文，在對(duì)Western Blot實(shí)驗(yàn)圖像中條帶背景扣除方法技術(shù)細(xì)節(jié)上，大家一直惜墨如金。究其原因可能有很多：

       1）或許是因?yàn)橛蠦io-Rad Quantity One或Image Lab Software，GE ImageQuant TL，AlphaView Software和UVP LS Software等專業(yè)凝膠圖像分析軟件的加持，軟件內(nèi)置背景扣除功能破解了數(shù)據(jù)分析中這道難題且屢試不爽，背景對(duì)這部分實(shí)驗(yàn)人員不算事；

       2）或許是Subtract Background這個(gè)環(huán)節(jié)太easy了，細(xì)節(jié)處理好壞，并不影響實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)的顯著差異，因而不屑一顧，故也就不足掛齒；

       3）背景扣除操作規(guī)則還缺少明文公約，操作過(guò)程主觀性極強(qiáng)，一言難盡。擔(dān)心過(guò)多討論沖淡主題，甚至引發(fā)對(duì)數(shù)據(jù)分析結(jié)論準(zhǔn)確性的質(zhì)疑。

       針對(duì)Western Blot圖像定量分析中背景校正環(huán)節(jié)滾球半徑的準(zhǔn)確理解運(yùn)用的困境，我們基于ImageJ軟件和反復(fù)實(shí)測(cè)基礎(chǔ)上，提出Rolling Ball半徑應(yīng)基于具體條帶的強(qiáng)度信號(hào)沿短軸信號(hào)分布范圍的設(shè)計(jì)放法，借助于ImageJ的Plot profile分析模塊，以條帶強(qiáng)度值分布形態(tài)為基礎(chǔ)創(chuàng)建ROI，并據(jù)此確定Rolling Ball半徑。

      本文還進(jìn)一步證實(shí)：基于短軸模式下創(chuàng)立的ROI條帶背景扣除方案，可直接應(yīng)用于常規(guī)長(zhǎng)軸模式下建立的ROI分析。前提是，兩種模式下建立的ROI位置、范圍和大小完全相同，以確保被分析的圖像像素完全一樣。此前《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實(shí)測(cè)》公開(kāi)的數(shù)據(jù)，全部基于條帶短軸分析模式產(chǎn)生。此驗(yàn)證測(cè)試結(jié)果，是對(duì)已發(fā)表結(jié)論的有力支持、完善和補(bǔ)充。這樣的益處顯而易見(jiàn)，有效避免了因擔(dān)憂圖像旋轉(zhuǎn)處理造成的圖像信息損失并因此引發(fā)的爭(zhēng)議與質(zhì)疑。

      創(chuàng)建ROI后如何計(jì)算Rolling ball的半徑值？請(qǐng)參考《Western Blot條帶分析中如何計(jì)算ImageJ的滾球半徑？》一文。

參考文獻(xiàn)：

   1. 在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應(yīng)用實(shí)測(cè)(上、下)

   2. Quantity One Version 4.4 User Guide（4000126-14，RevA）