在 Western Blot條帶定量分析時(shí)，到底是分析圖像的光密度（Optical Density, OD）還是圖像的灰度值（Grey Levels，GL）？

       有觀點(diǎn)認(rèn)為灰度與光密度兩種量化方法都行，隨意。有人提出WB一般分析都是積分光密度（Integral Optical Density，IOD）。還有的提出灰度應(yīng)逐漸被光密度或吸光度取代^［1］。

       就此問題，阿拉斯加科技基于PubMed進(jìn)行了專題調(diào)研。分別采用grey Level + western blot和optical density + western blot兩組關(guān)鍵詞，檢索區(qū)域限定為[Text Word]和發(fā)文時(shí)間[PDat：2016/01 - 2021/01]。了解近5年發(fā)文中國(guó)內(nèi)外學(xué)者的對(duì)此問題“主流”意見。對(duì)檢索記錄初步整理，結(jié)果如下：

(數(shù)據(jù)來(lái)源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)

      檢索結(jié)果顯示，在western blot圖像分析中，采用圖像的grey Levels值與采用optical density值分析的論文數(shù)量比為1:276。把發(fā)文時(shí)限前推至2011/01后，則這一比例為255:18124 = 1:71。換言之，前5年基于光密度值分析的論文比例為98.6%，后5年該比例微升至99.6%，僅0.4%的論文采用條帶灰度值分析。堅(jiān)持WB條帶定量分析圖像灰度值論者，儼然成了當(dāng)今的“瀕危保護(hù)”人群。

      對(duì)這87篇基于圖像灰度值進(jìn)行WB條帶定量分析的論文簡(jiǎn)單梳理后發(fā)現(xiàn)，部分文章發(fā)表在諸如CANCER CELL (2019 IF 26.602)，CELL RES (2019 IF 20.507)，NAT COMMUN (2019 IF 12.121)，THERANOSTICS (2019 IF 8.579，Clin Transl Med (2019 IF 7.919)，BRIT J PHARMACOL (2019 IF 7.73) 等影響因子頗高的著名期刊上。據(jù)此看來(lái)，基于兩種圖像強(qiáng)度值數(shù)據(jù)的分析方法，并無(wú)先進(jìn)落后之分，僅僅是使用人群的大小眾的問題。

      那為什么眼下呈現(xiàn)一邊倒用光密度值而非灰度值做WB圖像的條帶定量分析？要回答這個(gè)問題，還要從光密度和灰度的本質(zhì)涵義說(shuō)起。

1. 圖像灰度值

      無(wú)論CCD還是CMOS傳感器，原理都是光子照射在圖像傳感器光敏面上產(chǎn)生光電效應(yīng)，像素上激發(fā)出電子。在曝光時(shí)間內(nèi)，電子持續(xù)生成并在內(nèi)部電容不斷積累形成電壓信號(hào)。電路對(duì)每個(gè)像素電壓信號(hào)進(jìn)行放大和模數(shù)轉(zhuǎn)化等處理，每個(gè)像素對(duì)應(yīng)的光信號(hào)用一個(gè)0-255之間某個(gè)相應(yīng)數(shù)值表示：0表示黑-沒有光信號(hào)，255表示白-光信號(hào)強(qiáng)度最大，用1-254值表示處于黑白之間的顏色深淺（灰度）。這樣形成了反映拍攝對(duì)象各部光線強(qiáng)弱（灰度值）的二維陣列，最終圖像灰度值以數(shù)字信號(hào)形式輸出，即輸出了數(shù)字化圖像。

      因此，圖像灰度值代表源自于樣品反射的照明光源（reflective light）、自發(fā)熒光或外部激發(fā)標(biāo)記熒光、樣品的生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光等光信號(hào)強(qiáng)弱。樣品發(fā)射的光信號(hào)越強(qiáng)，像素獲得的光子和集聚的電信號(hào)越強(qiáng)，形成的像素灰度值越高，生成的數(shù)字圖像對(duì)應(yīng)的像素越亮。這樣，圖像亮度（灰度值大小）與可發(fā)光樣品多少即濃度/含量，存在關(guān)聯(lián)（正相關(guān)）。

      故在凝膠成像分析儀對(duì)于采用EB、GelGreen，SYBR Green，SYBR Safe等標(biāo)記的和SYPRO Ruby蛋白凝膠的熒光染料激發(fā)熒光、自發(fā)熒光，Western Blot印跡膜HRP-ARP化學(xué)發(fā)光樣品采集的圖像，應(yīng)該采用灰度值分析法分析。

2. 圖像光密度值

      要說(shuō)清光密度（Optical Density, OD）的涵義，還須從比爾-朗伯定律（Beer–Lambert law）或朗伯-比爾定律（Lambert–Beer law）開始。

      朗伯-比爾定律是光通過(guò)物質(zhì)時(shí)被吸收的定律，作為吸光光度法、比色分析法和光電比色法的定量基礎(chǔ)理論，適用于電磁輻射和所有吸光物質(zhì)（包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子）。其物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過(guò)某一均勻、非散射吸光介質(zhì)體系時(shí)，因介質(zhì)吸收了一部分光能，在透過(guò)一定厚度介質(zhì)后，透射光的強(qiáng)度減弱。如介質(zhì)中的吸光質(zhì)點(diǎn)之間無(wú)相互作用，入射光與介質(zhì)內(nèi)部之間的作用僅限于光吸收,無(wú)熒光和光化學(xué)現(xiàn)象發(fā)生，且介質(zhì)的吸光度在0.2-0.8之間。此時(shí)比爾-朗伯定律數(shù)學(xué)表達(dá)式成立：

      其中：I為透射光強(qiáng)度，I0為入射光強(qiáng)度；吸光度(Absorbance, A)指光線通過(guò)溶液或介質(zhì)前的入射光強(qiáng)度I0與該光線通過(guò)溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度I比值的對(duì)數(shù).

      而光密度(Optical density, OD)同樣定義為入射光與透射光比值的對(duì)數(shù)。故本質(zhì)上，光密度(OD)等同吸光度(A)［^2］。

      光吸收介質(zhì)的濃度愈大，厚度愈厚，則入射光穿透介質(zhì)后光強(qiáng)度的減弱愈顯著，對(duì)應(yīng)的吸光介質(zhì)的吸光度（光密度）越大。光路上樣品濃度/含量大，則光密度大，落實(shí)到光學(xué)成像上，光密度掃描儀和凝膠成像分析儀等采集到的圖像越暗。

      標(biāo)準(zhǔn)光密度法適用于采用透射光(transmitted light)成像檢測(cè)獲取的圖片的量化分析^［2］。即：進(jìn)入圖像傳感器采集的光信號(hào)與檢測(cè)入射光線為同一束光（而非樣品經(jīng)入射光激發(fā)后產(chǎn)生的熒光、自發(fā)熒光或生物、化學(xué)發(fā)光），樣品含量與對(duì)檢測(cè)入射光的吸收削減作用呈線性關(guān)系，都可以基于圖像的光密度值進(jìn)行量化分析。

      根據(jù)比爾-朗伯定律，凝膠成像分析儀使用白光轉(zhuǎn)換板采集的考馬斯亮藍(lán)染色蛋白電泳凝膠圖像，比色分析實(shí)驗(yàn)圖片和采用光密度儀掃描采集的放射線自顯影膠片圖像，應(yīng)該采用圖像光密度值為依據(jù)進(jìn)行量化計(jì)算^［2］。

      如入射光與吸光介質(zhì)內(nèi)部之間并非限于光吸收,同時(shí)激發(fā)產(chǎn)生了熒光（如入射光源為302nm紫外光，激發(fā)核酸標(biāo)記EB染料后發(fā)射595nm波長(zhǎng)橙紅色熒光），或有光化學(xué)現(xiàn)象發(fā)生，此時(shí)，圖像感光器接收的光信號(hào)，比爾-朗伯定律不再適用。

3. 光密度與灰度的轉(zhuǎn)換關(guān)系

      數(shù)字化圖像記錄的是各像素的灰度值，但不同樣品因成像機(jī)制不同，圖像的黑與白所代表的含義存在根本區(qū)別。因此，應(yīng)回歸圖像本來(lái)內(nèi)涵，選擇到底是基于圖像的光密度值抑或圖像的灰度值，對(duì)圖像進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)分析。

      在軟件ImageJ 1.46r的操作指南中^［2］ ，專門給出了像素未經(jīng)校正的初始光密度值（Uncalibrated OD）和像素灰度值間的轉(zhuǎn)換公式。即：

       而UVP VisionWorks LS軟件操作指南^［3］中，給出圖像特定像素P(x,y) 經(jīng)校正后OD值與像素灰度值的計(jì)算公式如下：

      當(dāng)P(x,y) < black（即黑色圖像白色背景）時(shí)：

       其中，Incident =整個(gè)圖像中最亮的像素值，Black =整個(gè)圖像中最暗的像素值。

      當(dāng)P(x,y) ＞black（即白色圖像黑色背景）時(shí)，公式2可表述為：

       比較發(fā)現(xiàn)，公式1和公式2、3，本質(zhì)含義一致的。

       兩個(gè)軟件給出的公示傳遞的信息是：

       無(wú)論暗底亮條型圖像（如Western Blot原始圖像、EB等熒光染料標(biāo)記的DNA電泳凝膠圖像），還是亮底暗條型圖像（如經(jīng)典的采用放射性自顯影方法檢測(cè)的Western Bot底片圖像，可見光照明下考馬斯亮藍(lán)染色、銀染的蛋白凝膠圖像），計(jì)算機(jī)記錄的是圖像像素強(qiáng)度值（pixel value）都是灰度值（grey Levels）。

       可見，不同實(shí)驗(yàn)圖像，無(wú)論是普通凝膠圖像，還是Western Blot條帶圖像，灰度值所代表的內(nèi)涵并不一致。

       提示，在對(duì)圖像量化分析時(shí)，所分析圖像強(qiáng)度值，到底是像素灰度值，還是光密度值來(lái)，必須結(jié)合圖像本身屬性，心中有數(shù)。WB條帶定量中到底是分析圖像灰度值還是光密度值，泛泛而談則毫無(wú)意義。

4、結(jié)語(yǔ)

       把NIH在生物醫(yī)學(xué)界人士心中的地位比作阿拉伯民眾眼中的麥加城，并不為過(guò)。但凡研究生開始就從NIH的PubMed數(shù)據(jù)檢索和免費(fèi)便捷下載服務(wù)受益的生物醫(yī)學(xué)研究者，對(duì)NIH信息平臺(tái)服務(wù)的信賴，是不言而喻的。
       20世紀(jì)80年代初，為解決x光片圖像分析處理難題。NIH的程序員韋恩?拉斯班德（Wayne Rasband）編寫了ImageJ分析處理軟件，從此，研究人員得以在計(jì)算機(jī)上查看和分析數(shù)字圖像。

       這款軟件因?yàn)楣δ軓?qiáng)大、權(quán)威性和無(wú)償分發(fā)使用模式，其圖像分析應(yīng)用的影響力，早已超越生物醫(yī)學(xué)圖像范疇，被拓展到到諸如地質(zhì)地理、材料科學(xué)、農(nóng)業(yè)食品、城市建設(shè)、園林綠化等等眾多領(lǐng)域。2021年，Nature雜志將ImageJ列為改變科學(xué)10個(gè)計(jì)算機(jī)代碼項(xiàng)目之一，可見一斑。
       本文得以成文，也正是受ImageJ的User Guide啟發(fā)的結(jié)果。
       關(guān)于Western Blot條帶定量分析到底是基于條帶光密度還是灰度值的問題，總結(jié)起來(lái)三句話。
1）因圖制宜
       暗底白帶型WB條帶圖像的分析值，理當(dāng)是基于圖像的灰度值GL；而目前發(fā)文中千篇一律的淺底暗帶圖片（仿經(jīng)典放射性自顯影風(fēng)格），分析時(shí)理應(yīng)將原始灰度值數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為OD值后再分析比較。至于有學(xué)者認(rèn)為圖像分析揚(yáng)棄圖像灰度值分析法，我們認(rèn)為：要依圖片屬性來(lái)定。
2）實(shí)事求是
       發(fā)文如提供了圖像強(qiáng)度（Density / intensity）統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)，則應(yīng)跟于上一條的規(guī)則，明確分析數(shù)據(jù)是條帶圖像的OD還是GL，不可張冠李戴混為一談。
3）灰度分析靠譜
       在ECL法學(xué)發(fā)光成像的原圖直接采用選區(qū)灰度值進(jìn)行量化分析，不僅方法沒錯(cuò)，事實(shí)上基于灰度值的統(tǒng)計(jì)分析完全可行。詳情可參考《圖像灰度值在Western Blot條帶定量分析中應(yīng)用實(shí)測(cè)》（上、下）。

參考文獻(xiàn)：

1. 李楓.圖像分析中光密度參數(shù)物理意義的正確理解和使用.解剖學(xué)雜志，2009,32(2):271-274

2. ImageJ IJ 1.46r User Guide

3. Life Science Software Installation and User Instructions Rev L (81-0254-01)