應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-3

       實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀的熒光檢測(cè)單元通常包括了寬譜基礎(chǔ)光源、入射激發(fā)光模塊、發(fā)射熒光模塊和熒光信號(hào)采集數(shù)碼相機(jī)等基本組件。針對(duì)特定熒光基團(tuán)的光吸收、熒光發(fā)射光譜特征，將最適的激發(fā)光濾鏡模塊、發(fā)射光濾鏡模塊藕聯(lián)，組成了波長(zhǎng)范圍固定的光學(xué)通道用于采集熒光信號(hào)。每一色熒光對(duì)應(yīng)一個(gè)專用通道，如FAM/SYBR GREEN青-綠色光通道、VIC/HEX/TET綠-黃綠通道等，可確保檢測(cè)靈敏度與準(zhǔn)確性。

       曾經(jīng)，人們把熒光定量PRC儀內(nèi)部這樣一個(gè)光學(xué)通道稱為一“色”，并按通道配置數(shù)量在儀器名稱中加以區(qū)分。如1995年推出的ABI PRISM 7700 Sequence Detection System實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，配有FAM, JOE, HEX及TET四個(gè)檢測(cè)通道，稱為4色定量PCR儀。DNA Engine Opticon 2只配置了用于SYBR Green I /FAM、HEX/TET/ VIC/TAMRA兩種波長(zhǎng)熒的光檢測(cè)通道，故名Two-Color Real-Time PCR Detection System。如今，新型qPCR儀諸如QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Pro，CFX96-touch、CFX Opus 96、LightCycler 480 II等，熒光檢測(cè)通道數(shù)量達(dá)到6個(gè)，卻不見人用6色實(shí)時(shí)定量PCR儀來冠名。

       是什么削弱了熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)通道的數(shù)量與可檢測(cè)熒光色數(shù)之間的聯(lián)系？6通道qPCR儀能進(jìn)行6色熒光的檢測(cè)嗎？

一、ROX參比熒光校正占用了屈指可數(shù)的熒光檢測(cè)通道資源

       對(duì)于qPCR定量實(shí)驗(yàn)中引入ROX參比熒光對(duì)報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)及非PCR反應(yīng)造成的熒光信號(hào)波動(dòng)均一化（Normalization）的必要性，業(yè)內(nèi)外歷來是仁智互見、各執(zhí)一詞。

1.1 qPCR實(shí)驗(yàn)ROX校正有用論

       支持加入ROX參比熒光校正者認(rèn)為，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用ROX熒光染料的意義，至少有4個(gè)方面：

       1.1.1 校準(zhǔn)各孔反應(yīng)體系構(gòu)建時(shí)PCR組份移液加樣操作誤差，消除反應(yīng)濃度或體積變化引起的孔間熒光信號(hào)強(qiáng)度波動(dòng)；

       1.1.2 將同一次運(yùn)行中全部報(bào)告熒光基團(tuán)信號(hào)的強(qiáng)度均一化，校正不同位置反應(yīng)孔釋放的熒光信號(hào)因與CCD間光程不同引起的強(qiáng)度誤差；

       1.1.3 消除儀器檢測(cè)器本身噪音引起的熒光信號(hào)波動(dòng)，同時(shí)為多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析提供穩(wěn)定基線；

       1.1.4 ROX染料不干擾實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率和特異性、報(bào)告熒光基團(tuán)的信號(hào)檢測(cè)。

       TaqMan Universal PCR Master Mix（TaqMan 通用實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混試劑）、TaqMan Fast Advanced 預(yù)混液中都含有ROX染料。讀取ROX校正熒光信號(hào)要單獨(dú)占用一個(gè)檢測(cè)通道，則待測(cè)試樣品檢測(cè)探針不能采用與ROX具有相同光譜特征的報(bào)告熒光染料，結(jié)果必然是樣品可用的熒光信號(hào)采集通道減少一個(gè)。這在multiplex多色熒光定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中尤其重要。使用4通道的StepOnePlus熒光定量PCR儀最多能在單管內(nèi)進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增3個(gè)靶序列。若要完成4重PCR定量分析（quadruplex qPCR assays），就需采用像7500、7500Fast、QuantiStudio 5、QuantiStudio 6/7Pro、QuantiStudio 6/7 Flex 和CFX 96 Touch、CFX Opus 96等配置更多色熒光通道的平臺(tái)上進(jìn)行。

1.2 qPCR實(shí)驗(yàn)ROX校正無用論

       也該觀點(diǎn)的認(rèn)為熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中引入ROX參比熒光校正毫無意義。

       理由主要是：

       1.2.1 定量實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系包括了通用PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑、正反向引物對(duì)、探針、樣本或標(biāo)準(zhǔn)模板在內(nèi)多種組份。對(duì)組份的加樣操作誤差是客觀存在的，幾乎是每一輪組份的加樣移液，本質(zhì)上都是在引入并不斷積累誤差。

       以PCR實(shí)驗(yàn)常用的微量移液器為例，視單次移液量和所用的移液器規(guī)格不同，每次操作都可能存在1-2.5%甚至更高的系統(tǒng)誤差、0.3-1.5%的隨機(jī)誤差。

表1 常用單道可調(diào)量程微量移液器加樣誤差表

（數(shù)據(jù)來源于eppendorf官網(wǎng)）

       事實(shí)上，反應(yīng)組份越復(fù)雜、手工操作次數(shù)越多，系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和人為操作精度誤差綜合后必造成各反應(yīng)孔最終擴(kuò)增體系的體積、組份濃度的細(xì)微區(qū)別。通過改進(jìn)操作儀器精度、操作熟練程度、提高PCR反應(yīng)體系構(gòu)建的自動(dòng)化程度，誤差固然可以縮小。但移液加樣誤差單靠PCR預(yù)混試劑中ROX信號(hào)強(qiáng)度歸一化是無法有效消除的。大量實(shí)驗(yàn)也證明，即便依然存在誤差，只要控制在一定范圍內(nèi)，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生根本性影響。因此，添加ROX組份可視作一種無用功。

       1.2.2 不同品牌型號(hào)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的光學(xué)檢測(cè)單元結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)存在區(qū)別，對(duì)采用ROX信號(hào)校正PCR反應(yīng)板各孔熒光信號(hào)光程誤差的必要性是完全不同的。

       伯樂CFX 96-touch、CFX Opus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)為光梭式設(shè)計(jì)（optics shuttle）。光梭移動(dòng)呈現(xiàn)“弓”字形軌跡，從A1 →A12 →B12 →B2 →C3 →C12……直至H12走完整板全部96個(gè)反應(yīng)孔。

        當(dāng)采集某一孔的某種熒光信號(hào)時(shí)，光梭中的步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)特定光學(xué)通道移到被檢測(cè)PCR孔正上方精確對(duì)焦，再啟動(dòng)激發(fā)、熒光信號(hào)采集。不同檢測(cè)通道、不同反應(yīng)孔是等距掃描和信號(hào)采集，不存在反應(yīng)孔間熒光光程和誤差問題，故無需引入ROX校正。

       既然無需ROX參比熒光，則與之對(duì)應(yīng)的560-590nm波長(zhǎng)檢測(cè)通道就可用作Texas Red/CAL Fluor Red 610這類報(bào)告熒光探針檢測(cè)信號(hào)采集。在伯樂CFX Opus 96 real time PCR Detection system可選擇FAB、HEX/VIC、Texsa Red、CY5和CY5.5組合完成分別用5種顏色標(biāo)記探針實(shí)施5個(gè)靶基因的同步檢測(cè)。

       對(duì)引入ROX參比信號(hào)校正存在的截然相反意見且各自所指導(dǎo)的qPCR實(shí)驗(yàn)已踐行多年，故qPCR儀運(yùn)行編程界面都有ROX設(shè)置選項(xiàng)，便于實(shí)驗(yàn)者基于自身經(jīng)驗(yàn)和試劑使用說明自由決定。

       因此，不同品牌型號(hào)qPCR儀，如Applied Biosystems 7500 VS  Stratagene_Mx3500P，雖均為5個(gè)檢測(cè)通道，但在實(shí)際使用中，因不同實(shí)驗(yàn)、不同探針和配套試劑不同，在Multiplex多色定量分析中可同時(shí)檢測(cè)的靶標(biāo)種數(shù)可能不同。

        簡(jiǎn)單地將系統(tǒng)檢測(cè)通道數(shù)量與Multiplex反應(yīng)中熒光色數(shù)掛鉤劃等號(hào)不僅沒有意義，反而有犯錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)。

二、FRET探針檢測(cè)引入使qPCR儀多色熒光檢測(cè)通道“灌水”

       羅氏LightCycle系列 FRET探針，又稱雙雜交探針（HybProbe Probes），由兩條分別能與靶片段上下游兩個(gè)相距1-5bp的特異結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的探針組成。上游探針3`端標(biāo)記的是熒光素（Fluorescein），作為下游探針熒光能量的供體(Donor)；下游探針5`端標(biāo)記受體熒光基團(tuán)，如LightCycle Red 610、LightCycle Red 640和Cy5等，作為FRET效應(yīng)的能量傳導(dǎo)受體(Acceptor)。

       在PCR循環(huán)的復(fù)性階段，兩條探針同時(shí)結(jié)合到靶片段上。上游探針末端供體基團(tuán)被入射光激發(fā)產(chǎn)生熒光。此時(shí)因供、受體基團(tuán)緊緊相鄰而發(fā)生FRET反應(yīng)，受體基團(tuán)吸收供體發(fā)出的綠色熒光能量后以波長(zhǎng)更長(zhǎng)的黃色、橙色或紅色熒光釋放出能量。系統(tǒng)檢測(cè)器通過優(yōu)化的濾光片配置，濾除上游供體基團(tuán)發(fā)射的熒光，只采集下游受體釋放的熒光信號(hào)用作分析。

       以LightCycler 480 II的Mono Color HybProbe 檢測(cè)模式為例。采用HybProbe Fluorescein (Donor) +LightCycler Red 640 (Acceptor)探針組。采用498nm初始激發(fā)光源激發(fā)供體，釋放510 nm波長(zhǎng)的熒光，經(jīng)FERT機(jī)制能量被受體吸收后，Red 640煥發(fā)640 nm波長(zhǎng)的熒光。而CCD前端配的正是618-660nm帶寬Emission Filter而非常規(guī)FAM/SYBRGreen I檢測(cè)通道用的510 nm濾光片，可以有效濾除供體殘余熒光信號(hào)。常規(guī)FAM/SYBRGreen I專用熒光通道無法檢測(cè)HybProbe探針FRET熒光，而FRET檢測(cè)通道只能為HybProbe探針提供專享服務(wù)。

       若要進(jìn)行FAM和Red 640組合的單管多重實(shí)時(shí)定量分析，qPCR儀必須同時(shí)具備常規(guī)FAM/SYBRGreenI檢測(cè)通道和Fluorescein-LightCycler Red 640專用通道。兩種檢測(cè)通道的前端入射激發(fā)光模塊相同，但后端發(fā)射熒光濾光模塊不同。本質(zhì)上，F(xiàn)RET檢查波長(zhǎng)與常規(guī)TaqMan檢測(cè)波長(zhǎng)是重疊的。如Red 640專用通道檢測(cè)波長(zhǎng)的范圍(618-660nm)就與常規(guī)TaqMan探針ROX、Texas-Red所用的紅色熒光波長(zhǎng)（623±14nm）基本重疊。兩種探針競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)波長(zhǎng)資源，則必然造成因熒光信號(hào)竄擾（Cross-talk）而干擾檢測(cè)結(jié)果的問題。

        魚（TaqMan等水解型探針）和熊掌（FRET探針）只能二選一：每增加一個(gè)FRET專用通道，則要有一個(gè)TaqMan信號(hào)通道被替換掉。

三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)通道與multiplex多色檢測(cè)能力的區(qū)別與聯(lián)系

       20多年前，具有超凡遠(yuǎn)見卓識(shí)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀先驅(qū)開創(chuàng)了4熒光檢測(cè)通道的配置架構(gòu)，使采用FAM+VIC雙色熒光探針進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)（SNP Assays）和在單管內(nèi)多個(gè)基因同步檢測(cè)分析（multiplex）方法成為現(xiàn)實(shí)。

       系統(tǒng)配置的光學(xué)通道數(shù)量越多，多色熒光檢測(cè)應(yīng)用越靈活。

        但檢測(cè)通道數(shù)與可同步檢測(cè)熒光信號(hào)種數(shù)之間既聯(lián)系又有區(qū)別。原因就在于qPCR儀廠商、實(shí)驗(yàn)者對(duì)ROX熒光參比校正應(yīng)用、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）探針檢測(cè)功能要求的不同。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀熒光檢測(cè)通道與多重PCR反應(yīng)對(duì)比表

       在不引入ROX熒光參比校準(zhǔn)情況下，CFX96-touch、CFX Opus 96系統(tǒng)名義上是6個(gè)熒光檢測(cè)通道，但實(shí)際至多可進(jìn)行5色多重定量檢測(cè)，與配置5個(gè)熒光通道的7500 Fast系統(tǒng)最大檢測(cè)范圍相當(dāng)；而同屬3通道配置經(jīng)濟(jì)型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，CFX Connet只能進(jìn)行Duplex，但QuantiStudio 1最多可進(jìn)行triplex定量分析。

       盡管LightCycler 480 II具有6個(gè)檢測(cè)通道，但在多重定量模式下，由于FRET探針的上游供體熒光基團(tuán)Flourescin需占用FAM標(biāo)記探針激發(fā)通道，同時(shí)Flourescin發(fā)射光譜（515-530nm）與VIC/HEX/CAL Fluor Gold 540/Cal Fluor Orange 560/TET等第二個(gè)常用熒光通道激發(fā)光譜（515-535 nm）重疊，勢(shì)必會(huì)削弱FRET探針中Donor激發(fā)能量，因而須關(guān)閉VIC/HEX熒光通道?？梢?，因?yàn)闊晒饧ぐl(fā)通道、檢測(cè)通道工作光譜間的嚴(yán)重重疊干擾（“內(nèi)卷”？），LightCycler 480系列最多只能進(jìn)行4重定量檢測(cè)（4 Colors Hydrolysis Probes Assay Detection Format）（LightCycler Cyan 500：Ex 440nm/Em 488nm；FAM：Ex 498nm/Em 580nm；LightCycler Red 610：Ex 533nm/Em 610nm；Cy 5/Cy 5.5：Ex 618nm/Em 660nm）。若完全基于FRET探針實(shí)施multiplex實(shí)驗(yàn)，最多能執(zhí)行三重定量反應(yīng)（Fluorescein-LightCycler Red 610, Fluorescein-LightCycler Red 640, Fluorescein-Cy 5/Cy 5.5）。

（圖片來源https://lifescience.roche.com/en_cn/articles/lightcycler-480-detection-formats.html）

       可見，曾經(jīng)流行的將檢測(cè)通道數(shù)與多重定量PCR熒光色數(shù)直接“藕聯(lián)”形成的“N色實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀”概念已是名不副實(shí)、漏洞百出，甚至有混淆誤導(dǎo)視聽之嫌。目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)適用范圍，已不再沿用可檢測(cè)幾色熒光的說法，而是用標(biāo)注系統(tǒng)可支持的報(bào)告熒光基團(tuán)的列表的方式取代。

       討論到這，我們似乎可以回答本文開頭提出的問題了，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀能用于6色熒光檢測(cè)嗎？定性分析是可以的，若不引入ROX熒光校正設(shè)計(jì)的話，用于6-target的多重定量檢測(cè)也無妨，但如采用的是賽默飛原裝Taqman預(yù)混試劑和探針組合，那只能實(shí)現(xiàn)5色定量分析。

參考文獻(xiàn)

ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual(904989B,01/2001)

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 手冊(cè)

The LightCycler 480 Real-Time PCR System Brochure(2014)

LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5

CFX Opus Real-Time System（Bulletin 7279）