應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-4

       1991年，美國Cetus公司發(fā)明了利用Taq酶5'外切酶活性水解與模板雜交的寡核苷酸探針的方法，并命名為“TaqMan”（據(jù)說靈感源自一款叫“Pacman”吃豆人的電子游戲名)。該5’核酸酶處理技術(shù)連同PCR核心方法專利權(quán)隨著Roche并購Cetus后歸Roche Molecular Systems所有。

        墻內(nèi)開花墻外香。 

       Applied Biosystems公司將5' -3'核酸酶降解法與熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）結(jié)合，開發(fā)了用reporter dye (FAM) + quenching dye (TAMRA)雙色熒光標(biāo)記的探針信號(hào)系統(tǒng)，并與Genentech、Roche協(xié)作在ABI Prism 7700 Sequence Detector上驗(yàn)證取得成功。受益于PCR儀開發(fā)基礎(chǔ)和專利保護(hù)，ABI實(shí)時(shí)定量PCR儀很快就占據(jù)行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)地位，并極大推動(dòng)了Taqman探針檢測的廣泛應(yīng)用。

        Taqman探針技術(shù)炙手可熱，肥水不流外人田。 

       不甘躺平數(shù)錢（全球PCR和Taqman探針技術(shù)專利授權(quán)版稅）的羅氏，于是另起爐灶弄出個(gè)毛細(xì)管離心式模塊實(shí)時(shí)定量PCR儀，既要兼容各家不同熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的Taqman探針，又能給自家兩個(gè)冷貨——雙雜交探針（HybProbe Probes）和單探針（SimpleProbe Probes）帶貨。這在1999-2003年開發(fā)的LightCycler系統(tǒng)上表現(xiàn)尤為突出。

 表1 Detection Format for the LightCycler Instrument 

        LightCycler 1.2和改進(jìn)后的LightCycler 1.5均為3檢測通道布局：一個(gè)5’-核酸酶水解探針檢測通道（FAM/SYBR Green I）、2個(gè)HybProbe Probes 探針（Red 640和Red 710）專用通道。LightCycler用于常規(guī)定量分析還好辦，若要開展SNP基因分型探針實(shí)驗(yàn)，就只能用羅氏獨(dú)門暗器。

        LightCycler 2.0系統(tǒng)的檢測通道數(shù)增加到6個(gè)，其中有2個(gè)水解探針信號(hào)通道（FAM/SYBR Green I、HEX/VIC）。另外4個(gè)是清一色FRET專用通道，用于Red 610、Red 640、Red 670和Red 710探針的檢測。沒有對(duì)比就沒有傷害。測試通道多了固然可解決常規(guī)單重定量、多重定量和基因分型實(shí)驗(yàn)問題，但封閉毛細(xì)管耗材外加高冷專利探針售價(jià)，LightCycler 2.0依然飽受詬病。從LightCycler 1.2到LightCycler 2.0，羅氏雖一直在追趕ABI PRISM 7700，就是沒有實(shí)現(xiàn)超越。

       將羅氏從高級(jí)腹黑形象中拉出半個(gè)身子的是LightCycler 480。

       2005年，羅氏部分PCR核心專利到期，與ABI就定量PCR專利一通利益交換后，羅氏首款采用金屬熱循環(huán)模塊的LightCycler 480面世，并于2008升級(jí)為LightCycler 480 Instrument II。這是羅氏脫掉紳士禮服要光著膀子上陣搶大餅的節(jié)奏。

        人們洶涌澎湃的qPCR實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，逼著羅氏放下身段，走了一條水解探針與雙雜交探針并重的技術(shù)路線。LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是6個(gè)通道設(shè)計(jì)，但采用的是3個(gè)水解探針通道+3個(gè)FRET專用通道的1:1方案，裁掉了LC Red 705 FRET通道，新增一個(gè)LC Cyan 500水解探針通道。最關(guān)鍵的是，通過新增的533nm、618nm兩種激發(fā)光源，可以直接檢測采用LC Red 610、LC Red 670標(biāo)記的水解探針信號(hào)。

        LightCycler 480 II的檢測應(yīng)用模式中，除SNP檢測在力推FRET雙雜交探針，Endpoint Genotyping 、Quantification應(yīng)用提供的是常規(guī)水解探針方案。

        嘗試通過檢測通路的技術(shù)融合來提升平臺(tái)功能和兼容性的，絕非羅氏一家，且已然成了實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測通路技術(shù)發(fā)展的一個(gè)趨勢。

        伯樂公司，既沒有控制PCR儀核心專利，也與TaqMan探針、FRET雙雜交探針專利無緣。然而，CFX96 real-time PCR detection system別出心裁，在TaqMan探針檢測功能之外引入了FRET探針專用檢測通道，系統(tǒng)編程中專門提供了FRET模式選項(xiàng)。這樣的拿來主義，既鞏固了自身鐵粉，又可從ABI、羅氏的飯圈挖墻腳。從CFX9、CFX384開始，到CFX96-Touch、CFX384-Touch，直至最新CFX Opus 96、CFX Opus 384實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，概莫如此。

       也是在2010年前后，ABI一改沿用十余年的光學(xué)耦合檢測通道技術(shù)，開發(fā)了Enhanced OptiFlex System（增強(qiáng)型OptiFlex 光學(xué)系統(tǒng)）并率先應(yīng)用于ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。這個(gè)OptiFlex光路系統(tǒng)到底亮點(diǎn)在哪？

       傳統(tǒng)qPCR熒光檢測通路中，一旦設(shè)定探針為VIC標(biāo)記染料，系統(tǒng)自動(dòng)驅(qū)動(dòng)520nm/560nm這對(duì)光學(xué)濾鏡進(jìn)入檢測工位。

       OptiFlex光路單元有6個(gè)激發(fā)濾片和6個(gè)發(fā)射濾片工位，但激發(fā)、發(fā)射過濾組件不再是固定耦合關(guān)系，是各自獨(dú)立?？筛鶕?jù)探針標(biāo)記染料光學(xué)特征，可任意將發(fā)光濾鏡、發(fā)射光濾鏡組成臨時(shí)檢測通道，還也可以出廠定制特殊激發(fā)、發(fā)射濾鏡。ABI宣稱OptiFlex系統(tǒng)可兼容21種常見染料，可使多重?zé)晒鈾z測等應(yīng)用中熒光染料的選擇具有更大靈活性。其實(shí)，拋去華而不實(shí)和矜持，OptiFlex的設(shè)計(jì)初衷恐怕有點(diǎn)瞄準(zhǔn)羅氏FRET探針檢測的成份。 

       羅氏探針難道真的可以在搭載了OptiFlex光學(xué)通路的ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上檢測嗎？這是個(gè)好問題。 

       FRET雙雜交探針中的Acceptor，如LC Red 610、LC Red 640、LC Red 670、Cy5等，本質(zhì)就一個(gè)普通熒光信號(hào)Reporter。并非只有498nm激發(fā)光源和通過Donor-Acceptor能量FRET這一種檢測途徑，還可以直接用533nm、580nm、618nm激發(fā)光源和相應(yīng)的610nm、640nm、705nm熒光濾鏡采集熒光信號(hào)。選擇與FRET探針檢測匹配的激發(fā)、發(fā)射濾光片有機(jī)組合固然可以實(shí)現(xiàn)HybProbe Probes完美檢測。而繞過FRET機(jī)制中的Donor熒光素，直搗黃龍激發(fā)探針的reporter熒光基團(tuán)和檢測，可行性是毫無疑問的。 

表2 Filter Set of the LightCycler 480 Instrument 

        LightCycler 480 Instrument II僅用498nm、533nm、618nm三個(gè)激發(fā)濾鏡與610nm、640nm、660nm、670nm四個(gè)發(fā)射熒光濾光片即組成了FRET探針檢測標(biāo)準(zhǔn)解決方案。這對(duì)于激發(fā)、發(fā)射模塊可自由組合的OptiFlex光路系統(tǒng)而言，構(gòu)建相似方案絕非難事。  

表3 Instrument filters and supported dyes 

        ABI的ViiA7 、QuantiStudio 5（QS 5）、QuantiStudio 7 Pro （QS 7 Pro）、QuantiStudio 7 Flex （QS 7 Flex）和QuantiStudio 12 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，標(biāo)準(zhǔn)配置為非藕聯(lián)的光學(xué)測通道配置（decoupled six-by-six-color filter set），可以輕松完成Ex498 nm/Em623 nm(LC Red 610、LC Red 640)，Ex498 nm/Em682 nm(LC Red 670、Cy5)和Ex498nm/Em711 nm(LC Red 705、Cy5.5)的FRET探針光學(xué)檢測通路的組建。 

       另外，F(xiàn)ERT探針熒光信號(hào)采集的時(shí)間點(diǎn)是在探針與擴(kuò)增片段結(jié)合階段，即退火/復(fù)性階段。這與ABI默認(rèn)退火/延伸階段信號(hào)采集設(shè)置是一致的。 

      FRET雙雜交探針通道數(shù)據(jù)采集持續(xù)約10-46ms。如果QuantiStudio 系列平臺(tái)與ABI Prism 7700熒光定量PCR儀CCD默認(rèn)曝光時(shí)間基本一致（即25ms，有待核實(shí)），而CCD的分辨率、動(dòng)態(tài)監(jiān)測范圍、信號(hào)檢測靈敏度等技術(shù)指標(biāo)接近或優(yōu)于LightCycler 480檢測單元相關(guān)參數(shù)，同樣符合測試要求。 

表4 LightCycler Instrument’s Specifications for the Detection System

       因此，參考LightCycler 480相應(yīng)檢測通道設(shè)置，立足于現(xiàn)有的QS5、QS7、QS 12和ViiA7實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行FRET探針信號(hào)檢測的嘗試與探索，在特殊條件下，是有積極意義的。 

       自從有了ViiA7，或更準(zhǔn)確點(diǎn)說是打用上解藕聯(lián)式（decoupled color filter set） OptiFlex光學(xué)通道，ABI定量PCR儀用戶再也不用為FRET檢測發(fā)愁了。 

參考文獻(xiàn)

[1] P. Mickey Williams. The Beginnings of Real-Time PCR. Clinical Chemistry, 2009; 55:4833–834

[2] LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5

[3] LightCycler 1.5 Instrument Operator’s Manual (Version 1.0)

[4] LightCycler 2.0 Instrument Operator’s Manual A (Software Version 4.1)

[5] ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual (904989B, 01/2001)

[6] QuantStudio 3 and 5 Real-Time PCR Systems Installation, Use and Maintenance (Revision C.0)