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操作規(guī)程
外泌體超速離心分離法基礎(chǔ)操作流程1 (譯稿)
阿拉斯加科技(北京)有限公司編譯（Ver.202309）
細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指從細(xì)胞質(zhì)膜（plasma membrane）上脫落或由細(xì)胞分泌的有脂質(zhì)雙層膜、內(nèi)部包裹有核酸、蛋白和脂質(zhì)等多種生物活性大分子的囊泡微粒。按囊泡膜起源的不同，細(xì)胞外囊泡一般分為外泌體（exosome, EXO）、微囊泡（microvesicle, MV）和凋亡小體（apoptotic body, AB）3大類。微囊泡是由細(xì)胞膜直接出芽形成的細(xì)胞外囊泡，體積相對(duì)較大，直徑100 - 1000 nm之間。凋亡小體是在細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生，由胞膜皺縮內(nèi)陷、分割包裹一團(tuán)胞質(zhì)中DNA及細(xì)胞器后形成的囊泡，體型最大，直徑100 - 5000 nm。外泌體是胞外囊泡中體積較最小的一種，由細(xì)胞內(nèi)多泡內(nèi)體(multivesicular endosome, MVE)與質(zhì)膜融合后通過胞吐作用釋放到細(xì)胞外，直徑30 - 150nm不等。
可見，細(xì)胞外囊泡的來源和分子組成具有異質(zhì)性。而同時(shí)，不同微小囊泡群體（如外泌體和微囊泡）在大小、內(nèi)容物、膜成分等生物物理學(xué)表型上又存在一定程度的重疊，將不同亞群完全分離純化在方法學(xué)尚有困難。因此，國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）在2018年研究指南中建議，在正式學(xué)術(shù)文件中將“exosomes（外泌體）”用“small EVs (sEVs)”(小細(xì)胞外囊泡)來表述，微囊泡和凋亡體則標(biāo)注為“medium EVs /large EVs” (m/lEVs)。
細(xì)胞外囊泡充當(dāng)細(xì)胞間通訊和物質(zhì)交換的介質(zhì)，在許多生理和病理過程中起著關(guān)鍵作用。其中，對(duì)外泌體的研究近年呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。但高純度和足夠數(shù)量的外泌體分離制備在技術(shù)上充滿挑戰(zhàn)。
國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）2016年10月份發(fā)布的用于細(xì)胞外囊泡隔離和表征的技術(shù)的首次全球調(diào)查報(bào)告——《Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey》中顯示，條件細(xì)胞培養(yǎng)基是使用最廣泛（83%受訪者）的外泌體分離起始樣品材料，而超速離心則是最常用的分離方法（81%的受訪者）。
外泌體超速離心分離法基礎(chǔ)操作流程中文譯稿，據(jù)法國(guó)居里研究所G. Raposo、A. Clayton等2006 年在Current Protocols in Cell Biology發(fā)表的《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》一文中Supplement 30 unit 3.22一節(jié)內(nèi)容編譯而成。為方便閱讀，對(duì)原文表格、圖片和編排等局部略有改動(dòng)。
一、細(xì)胞培養(yǎng)基來外泌體分離樣品離心操作流程示意圖
二、Current Protocols in Cell Biology 2006版外泌體超速離心分離基礎(chǔ)流程
Basic Protocol 1 for the exosome purification procedure based on differential ultracentrifugation
【實(shí)驗(yàn)材料】 |
調(diào)節(jié)培養(yǎng)基（Conditioned medium, CM）（制備方法見支持協(xié)議1步驟5） |
PBS緩沖液 |
TBS緩沖液(可選) |
低溫離心機(jī) |
50mL聚丙烯離心管 |
立式超速離心機(jī)（如Beckman Optima L-XP、Optima XPN和Optima XE系列）、角轉(zhuǎn)頭或水平轉(zhuǎn)頭 |
立式超離轉(zhuǎn)頭配套異質(zhì)聚合物超速離心管或PC透明離心瓶 |
微量移液器 |
臺(tái)式超速離心機(jī)（如Beckman TL-100、Optima MAX-XP和Optima MAX-LT）及配套轉(zhuǎn)頭 |
-80℃超低溫冰箱 |
【注意事項(xiàng)】 |
所有離心都應(yīng)在4℃下進(jìn)行。 |
如只進(jìn)行生化分析（如免疫印跡、蛋白質(zhì)組學(xué)、FACS分析等），離心管無菌即可，樣品非必須執(zhí)行滅菌操作。 |
有當(dāng)外泌體的最終應(yīng)用（如用于體內(nèi)或體外功能檢測(cè)）須達(dá)到無菌狀態(tài)時(shí)，需使用滅菌設(shè)備處理樣品。 須使用無菌超離心管，樣品操作在潔凈操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。 超離心管和管蓋消毒可用用70%乙醇浸泡、沖洗后，用無菌PBS沖洗兩次后將PBS清除干凈后密封備用。 超速離心角轉(zhuǎn)頭的轉(zhuǎn)頭蓋同樣需經(jīng)70%乙醇清洗處理后，在超凈臺(tái)無菌環(huán)境下完成裝樣和轉(zhuǎn)頭密封操作。 |
操作步驟】 |
【清除細(xì)胞和細(xì)胞碎片】 這一階段用低溫高速離心機(jī)，分三次以300xg、2000×g和10000xg順序差速離心的方法，去除活細(xì)胞，死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。操作共5個(gè)步驟，每步需將離心管中沉淀拋棄，留上清用于下一步操作。 |
1. 收集經(jīng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至50mL尖底離心管中，300×g離心10分鐘，去除沉淀，收集上清。 |
2. 上清經(jīng)低溫離心機(jī)上水平轉(zhuǎn)頭2000×g離心力4℃離心20分鐘。 |
3. 用移液器在距管底沉淀上方0.5cm處，小心采集上清。避免直接傾倒上清，確保上清不被沉淀顆粒污染。 上清轉(zhuǎn)移到適合于超離心轉(zhuǎn)子多聚異構(gòu)體管或PCR離心瓶中（備注：當(dāng)缺少可用于50 - 100mL管10000×g離心的低溫高速離心機(jī)及相應(yīng)轉(zhuǎn)子時(shí)，將該步驟轉(zhuǎn)移至超速離心機(jī)上進(jìn)行；如實(shí)驗(yàn)室離心條件具備，亦可直接用低溫高速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭及配套離心管離心）。 用防水記號(hào)筆在超速離心管底部沉淀發(fā)生一側(cè)做好沉淀物位置標(biāo)記。 |
4. 將理性帶標(biāo)記一側(cè)朝上安裝到轉(zhuǎn)頭中，10000×g離心力4℃離心30分鐘，沉淀細(xì)胞碎片。 |
【收集含外泌體組分】 從第一階段處理所得上清中4℃超速離心沉淀，收集包含細(xì)胞外囊泡和可溶性蛋白污染物的外泌體初提物。 |
5. 將步驟3離心后的上清轉(zhuǎn)移到一新超速離心管中。 若步驟3離心后無明顯可見的顆粒出現(xiàn)：使用的是水平轉(zhuǎn)頭離心則顆粒必聚集在管底部。若用角轉(zhuǎn)頭處理，則沉淀位于管的記號(hào)筆標(biāo)記側(cè)靠近管底部位置。 添加 PBS填充，使所有管中樣品容積不低于管最大容量的3/4（配平以確保離心管總重量一致，下同）。 用移液管取出上清液時(shí)，將試管保持一定角度，使沉淀始終覆蓋有上清液，液面降低至離沉淀高度0.5cm處停止移液（剩余上清廢棄處理，以避免吸入沉淀顆粒污染）。 |
6. 4℃ 下100000×g離心至少 70 分鐘（1小時(shí)+10分鐘）。 離心時(shí)間從離心力達(dá)到100000×g開始計(jì)算。 離心時(shí)間延長(zhǎng)至3小時(shí)不會(huì)損害外泌體。 |
7. 完全去除上清，收集沉淀。 角轉(zhuǎn)子離心后，可直接傾倒出上清。 水平轉(zhuǎn)子離心，須用移液管除去上清，并保留沉淀上方2 mm上清（以避免損失沉淀）。 |
【清洗外泌體】 初步分離獲得的外泌體組分含有較多可溶性蛋白污染組分。此階段通過大量PBS漂洗，再經(jīng)第二輪超速離心，去除可溶性蛋白污染成份。 |
8. 用微量移液器在1mL PBS緩沖液中重懸沉淀，將來自同一細(xì)胞材料的所有離心管重懸液集中在一個(gè)離心管中。然后加入PBS將完全填充滿。 這一步中可能因沉淀顆粒少而無明顯可見的顆粒。定角轉(zhuǎn)頭離心的樣品管管，在顆粒應(yīng)該生成管底靠外側(cè)位置上下沖洗來重懸。水平轉(zhuǎn)頭離心時(shí)，充分沖洗管底部，以確保樣品回收率。 |
9. 4℃ 下100000×g離心滿1 小時(shí)。 |
10. 完全移除上清 角轉(zhuǎn)子離心后，可直接傾倒去除上清液后，再將試管倒置并用移液器吸出管側(cè)面和管口處剩余液體，以盡可能完全除去上清液。 視沉淀量多少而定，繼續(xù)進(jìn)行步驟11a |
11a. 如形成有沉淀（沉淀體積約調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始體積的1/2000。50mL培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)于25μL沉淀），則加入50-100μL PBS或TBS緩沖液重懸沉淀（即外泌體成品）。 |
如步驟10中沉淀最終體積超過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始體積的1/2000或沒有可見顆粒，則進(jìn)行步驟11b操作。 |
11b. 外泌體樣品濃縮 上清用臺(tái)式超速離心機(jī)TLA-100.3轉(zhuǎn)子和厚壁開口管4℃下100000×g離心1小時(shí)后，完全去除PBS上清液，所得沉淀用新鮮20-50μL PBS重懸 |
【外泌體樣品保存】。 |
12.將各管中樣品以PBS統(tǒng)一定容至100μL后 -80℃儲(chǔ)存。 可有效保存1年。 但存儲(chǔ)期間應(yīng)避免發(fā)生反復(fù)凍融 |
三、基礎(chǔ)流程1局部替代流程（Alternate Protocol of Basic Protocol 1）
過濾替代離心消除大細(xì)胞碎片和膜 |
對(duì)于某些細(xì)胞（如小鼠樹突狀細(xì)胞）來源樣品（如腦脊液），可用0.22μm過濾器一個(gè)過濾步驟替代基礎(chǔ)流程1中的步驟1-6操作用于除去死細(xì)胞和大細(xì)胞碎片，同時(shí)保留了液體中的微小囊泡，以便通過超離心進(jìn)純化。 這個(gè)流程局部替代方案是否可行，需使用相同體積的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基、采集相同細(xì)胞、在同一時(shí)間分別用兩個(gè)流程分離外泌體后，通過比較兩種流程所得外泌體的收益率和質(zhì)量方能驗(yàn)證。 |
材料（參見基礎(chǔ)流程1）： 0.22-μm過濾器滅菌裝置（如Steritop; Millipore）； 100mL - 1L玻璃瓶，無菌； |
操作方法： 1. 通過在無菌瓶上連接真空的0.22μm過濾器對(duì)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基進(jìn)行除菌處理； 2. 過濾后的上清，如不立即進(jìn)行外泌體分離，則至多可在4℃下保存1周（上清4℃超過一周可能會(huì)導(dǎo)致一些外泌體的丟失）； 3. 余下的分離外泌體操作步驟與基礎(chǔ)流程中步驟8 – 12相同。 |
四、純化外泌體中超速轉(zhuǎn)頭及工作參數(shù)設(shè)置
Beckman Ultracentrifuge Rotor Information for Exosomes Purification
可用機(jī)型 | 超速離心轉(zhuǎn)頭 | 離心管材質(zhì)/容量 | 10k×g時(shí)轉(zhuǎn)速 | 12k×g時(shí)轉(zhuǎn)速 | 100k×g時(shí)轉(zhuǎn)速 | 110k×g時(shí)轉(zhuǎn)速 |
立式超速離心機(jī) Optima XPN-100 Optima XPN-90 Optima XPN-80 Optima XE-100 Optima XE-90 | SW 41 Ti甩平轉(zhuǎn)頭 SW 40 Ti甩平轉(zhuǎn)頭 | PA管/12mL | 7500 rpm | 8200 rpm | 24000 rpm | 25000 rpm |
SW 28 Ti甩平轉(zhuǎn)頭 SW 32 Ti甩平轉(zhuǎn)頭 | PA管/30mL | 7500 rpm | 8200 rpm | 24000 rpm | 25000 rpm | |
Type 70 Ti角轉(zhuǎn)頭 | PC瓶/22mL | 10000 rpm | 11000 rpm | 31000 rpm | 32000 rpm | |
Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭 | PC瓶/68mL | 9000 rpm | 10000 rpm | 30000 rpm | 31000 rpm | |
臺(tái)式超速離心機(jī) Optima MAX-XP Optima MAX-TL | TLA-100.3角轉(zhuǎn)頭 | Thick-wall管/3mL | 13000 rpm | 15000 rpm | 43000 rpm | 45000 rpm |
TLA-110角轉(zhuǎn)頭 | PC瓶/5mL | 15500 rpm | 17000 rpm | 49000 rpm | 51400 rpm |
五、支持流程2：制備外泌體生產(chǎn)培養(yǎng)基
外泌體通常存在于用于組織培養(yǎng)的血清中。為避免這些外泌體污染，用于培養(yǎng)細(xì)胞的調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基必須去除污染外泌體。
去除血清衍生外泌體培養(yǎng)基有兩種選擇：
（1）如果細(xì)胞能在無血清條件下正常生長(zhǎng)，外泌體生產(chǎn)培養(yǎng)基可以作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，補(bǔ)充所有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗生素（胎牛血清FBS除外）；如細(xì)胞需要一些蛋白質(zhì)才能存活，可添加1%（w / v）牛血清白蛋白BSA代替FBS。
（2）如果細(xì)胞在無血清條件下不能存活，請(qǐng)按照此流程從含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中去除FBS來源的外泌體組分，以獲得排空FBS外泌體的外泌體生產(chǎn)培養(yǎng)基（predeplete the FBS-derived exosomes from FBS-containing medium）。
材料 |
含有所需營(yíng)養(yǎng)素（例如抗生素、L-谷氨酰胺、HEPES、2-巰基乙醇、FBS）的培養(yǎng)基 |
超速離心機(jī)和固定角度或水平吊斗轉(zhuǎn)子 |
適用于超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子的聚異構(gòu)體管或聚碳酸酯瓶 |
0.22 μm 過濾滅菌裝置（如密理博Steritop） |
100mL至1升玻璃瓶，無菌 |
操作步驟 |
1. 準(zhǔn)備已補(bǔ)充所有營(yíng)養(yǎng)素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加20% （v/v） FBS。 |
2. 超速離心排空外泌體 將培養(yǎng)基4℃下100000×g離心過夜（overnight）。 新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基用SW 28或SW 32甩平轉(zhuǎn)頭4℃下100000xg超速離心70分鐘，沉淀培養(yǎng)基內(nèi)自帶外泌體顆粒。 如使用可重復(fù)使用的離心瓶進(jìn)行外泌體排空操作，則外泌體分離操作與FBS培養(yǎng)基排空操作的離心瓶不得混用，以避免潛在血清內(nèi)體（serum endosomes）污染。 |
3. 過濾除菌 |
將離心瓶?jī)?nèi)上清倒入與真空泵連接的無菌0.22μm瓶頂濾器中，啟動(dòng)培養(yǎng)基進(jìn)行除菌處理。 |
注意離心管中沉淀顆粒，確保它不會(huì)松動(dòng)混入。 |
4. 稀釋培養(yǎng)基 |
稀釋過濾后的培養(yǎng)基，使FBS的最終濃度符合外泌體生產(chǎn)培養(yǎng)基的要求。 |
如細(xì)胞通常在10% FBS中培養(yǎng)，則用1倍體積的無FBS培養(yǎng)基稀釋排空外泌體處理的FBS培養(yǎng)基。 |
請(qǐng)勿使用純FBS進(jìn)行外泌體排空操作，因純FBS粘度大，超速離心導(dǎo)致純FBS所攜帶的對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利的蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子聚集沉淀。 |
5. 離心排空外泌體處理并過濾除菌的培養(yǎng)基在4℃下保存時(shí)有效期不超過4周。因此，應(yīng)在此期間完成外泌體分離實(shí)驗(yàn)。 |
參考資料：
［1］Clotilde Théry, Sebastian Amigorena, Gra?a Raposo, Aled Clayton. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; Chapter 3: Unit 3.22.
［2］Clotilde Théry, Kenneth W Witwer,￡ Elena Aikawa,et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018; 7(1): 1535750.
［3］Clotilde Théry, Sebastian Amigorena, Gra?a Raposo, Aled Clayton. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; Chapter 3: Unit 3.22.
