成大業(yè)若烹小鮮-1

一、PCR反應(yīng)密封操作不容忽視

        常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)中，PCR反應(yīng)板和管內(nèi)，樣品體積區(qū)區(qū)10–25μL甚至更少，再多也不過50μL，因此，液體上方存在巨大空間為空氣填充。緩沖液長時(shí)間都被控制在55℃以上的高溫，水分子蒸發(fā)從液面逸出，在反應(yīng)管液面以上空間積聚。從退火溫度升溫至模板雙鏈解鏈溫度所需的94℃-95℃溫度下，蒸發(fā)作用進(jìn)一步加劇，形成飽和蒸汽。當(dāng)溫度重新回落時(shí)，這部分水汽處于過飽和狀態(tài)，部分水蒸氣析出后將在溫度較低的管壁上冷凝，形成水滴后回流進(jìn)入底部反應(yīng)液中。在PCR過程中連續(xù)進(jìn)行。
        在PCR熱循環(huán)過程中，水分子受熱后蒸發(fā)進(jìn)入管內(nèi)空腔。在循環(huán)過程中，溫度可達(dá)到。在這么高的溫度下，水可揮發(fā)至孔內(nèi)的氣體空間內(nèi)。該水蒸氣或水流將在冷的管壁上冷凝，形成水滴后滴入底部的試劑中。在整個(gè)PCR過程中，蒸發(fā)-形成過飽和水蒸汽-冷凝掛壁或回流的水分子循環(huán)在連續(xù)進(jìn)行。
        而PCR熱蓋溫度高達(dá)105℃，熱蓋對密切接觸的管蓋具有熱傳導(dǎo)效應(yīng)，會使這部分水蒸汽溫度進(jìn)一步升高，蒸汽壓進(jìn)一步增大，容易引發(fā)管蓋彈開的爆管現(xiàn)象。此外，熱蓋對管蓋的擠壓作用，一旦壓力失衡，將對PCR管蓋的密封性能產(chǎn)生巨大挑戰(zhàn)。
        通常，高溫高壓條件下管蓋密封不嚴(yán)，PCR緩沖液蒸發(fā)水汽的泄漏，可能會造成2個(gè)方面的不良后果。

1）緩沖體系濃縮后PCR反應(yīng)的異常

        PCR技術(shù)應(yīng)用早期，由于PCR儀缺少防蒸發(fā)熱蓋，人們在PCR擴(kuò)增時(shí)普遍采用在反應(yīng)液面上添加一層石蠟油的方法，來減少PCR過程中，尤其是雙鏈DNA模板94-95℃變性階段，液體的蒸發(fā)。研究顯示，石蠟油保護(hù)有增加擴(kuò)增產(chǎn)物的作用，分析可能與其維持熱恒定和緩沖液中鹽濃度穩(wěn)定有關(guān)。
        一般認(rèn)為，反應(yīng)液中金屬陽離子的存在和濃度的適宜，對維持PCR產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量至關(guān)重要。
        在PCR緩沖液體系中，單價(jià)陽離子包括K+、Tris+等，雖然濃度都不高，但會對引物的Tm有影響。總體上，Tm隨總單價(jià)陽離子濃度的升高而升高，從而抬高了引物的退火溫度。K⁺濃度在50mmol/L 時(shí)能促進(jìn)引物退火而有助于增產(chǎn)，而KCl濃度高于50mmol/L則不僅會抑制Taq酶的活性使PCR擴(kuò)增效率降低，還使得原先設(shè)定的退火溫度低于此時(shí)引物最適退火溫度，造成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)。
        Mg²⁺作為PCR反應(yīng)必需輔離子，在一般PCR體系中的終濃度為1.5-2.5mM，在反轉(zhuǎn)錄PCR中需更高濃度。實(shí)驗(yàn)表明，液體蒸發(fā)濃縮引發(fā)Mg²⁺過量，同樣會加劇PCR非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生；
        因此，水份蒸發(fā)造成反應(yīng)體系中各組份的濃度，如模板、各種dNTP、Taq酶以及對PCR至關(guān)重要的Mg²⁺、K⁺濃度發(fā)生改變，直接影響PCR的產(chǎn)量和產(chǎn)物特異性。
        PCR緩沖液蒸發(fā)泄漏，還會極大制約10-20μL的小體積 PCR實(shí)驗(yàn)，同時(shí)對反應(yīng)結(jié)果帶來極大的不確定性。
        而實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)程中，反應(yīng)孔密封不當(dāng)時(shí)可出現(xiàn)“光學(xué)扭曲”現(xiàn)象，表現(xiàn)在擴(kuò)增曲線的變形，可能引起基線問題，甚至可影響Ct值，造成檢測數(shù)據(jù)的失真。

2）PCR產(chǎn)物外泄污染

       2021年4月22日，外媒披露，BGI在對香港4月20日采集的30個(gè)新冠檢測采樣檢測中，因樣品核酸提取制備過程操作流程不規(guī)范，發(fā)生樣本交叉污染，造成最終檢測結(jié)果中出現(xiàn)了9個(gè)假陽性病例的失誤，對實(shí)驗(yàn)室服務(wù)聲譽(yù)造成了負(fù)面影響。病毒含量相對較低測試樣品溢出污染，即足以動搖實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，若高濃度的PCR反應(yīng)產(chǎn)物泄漏，造成的樣品直接污染對實(shí)驗(yàn)的破壞和引發(fā)的實(shí)驗(yàn)室生物安全風(fēng)險(xiǎn)可想而知。

       同樣的，對實(shí)驗(yàn)室PCR儀、自動化核酸提取純化工作站等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室流程設(shè)備表面沾染的質(zhì)粒、基因組和擴(kuò)增DNA和RNA污染的防范和控制，有助于消除PCR過程中的假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

       業(yè)內(nèi)人士指出，PCR反應(yīng)體系溫度反復(fù)升降，液體蒸發(fā)冷凝，PCR管內(nèi)很容易形成攜帶有大量DNA擴(kuò)增片段的氣溶膠。反應(yīng)結(jié)束后打開PCR管蓋的動作過猛，或擴(kuò)增過程中管蓋受壓變形破裂時(shí)漏液，極易造成氣溶膠泄露、擴(kuò)散而污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境，引發(fā)生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

       因此，無論是防生物污染的生物安全實(shí)驗(yàn)室，還是普通生物醫(yī)學(xué)教學(xué)科研實(shí)驗(yàn)環(huán)境，在開始運(yùn)行PCR之前，必須確保PCR管和PCR反應(yīng)板進(jìn)行完全密封，以防實(shí)驗(yàn)中發(fā)生樣品的泄漏。

二、理性看待PCR儀熱蓋防蒸發(fā)的作用

       防蒸發(fā)熱蓋，即PCR儀熱蓋、Heated cover，是指PCR運(yùn)行時(shí)壓在PCR反應(yīng)孔密封蓋上可控制溫度的金屬導(dǎo)熱裝置。PCR實(shí)驗(yàn)啟動后，熱蓋溫度升至設(shè)定值（以105℃居多）后，系統(tǒng)啟動PCR熱循環(huán)過程，熱蓋的良好導(dǎo)熱效應(yīng)，使樣品管蓋的溫度始終高于反應(yīng)孔內(nèi)部溫度（通常不高于95℃）。因此，PCR緩沖液中受熱逸出的水分只能以飽和水蒸汽形態(tài)存在而無法在管蓋內(nèi)表面凝結(jié)聚集。隨著熱循環(huán)中樣品模塊溫度的變化，逃逸水分子在飽和水蒸汽-反應(yīng)液之間不斷游走、循環(huán)轉(zhuǎn)換，使得PCR反應(yīng)體積基本保持穩(wěn)定，不會因?yàn)槔淠龗毂诙鴾p少。

       目前，熱蓋在PCR儀主機(jī)結(jié)構(gòu)中已普遍應(yīng)用。只是不同品牌和機(jī)型，熱蓋溫度控制范圍略有區(qū)別。

       譬如，賽默飛MiniAmp Plus、SimpliAmp、VeritiPro、ProFlex PCR儀，熱蓋溫度只能在30℃ - 110℃范圍內(nèi)設(shè)定。

       熱蓋與反應(yīng)管密切接觸，熱蓋-管蓋的熱量會沿著管壁向下傳導(dǎo)。如熱蓋設(shè)定的溫度過高，可能會造成反應(yīng)樣品的溫度高于程序設(shè)定目標(biāo)溫度，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

       資料顯示，賽默飛PCR儀系統(tǒng)出廠默認(rèn)的熱蓋溫度值為105℃。伯樂C1000 Touch PCR儀的熱蓋溫度則視反應(yīng)模塊的樣品體積不同，采用不同熱蓋溫度（lid temperature）：96孔快速反應(yīng)模塊（96-Well Fast Reaction Module）或雙48孔反應(yīng)塊（Dual 48-Well Fast Reaction Module），系統(tǒng)默認(rèn)熱蓋溫度為105℃；而384孔反應(yīng)塊（384-Well Reaction Module），系統(tǒng)默認(rèn)溫度為95℃。

       熱蓋的作用是防止水汽在管蓋上冷凝聚集，但反應(yīng)孔液面以上封閉空間仍充滿高溫飽和水汽，這部分逸出的水分子始終無法參與PCR反應(yīng)。但如沒有熱蓋也不加石蠟油保護(hù)，PCR緩沖體系損失的水份體積之大，足以使各反應(yīng)組份濃度、反應(yīng)條件發(fā)生劇變。

       需指出，PCR儀熱蓋在工作中豎直向密封蓋施加壓力并升高管蓋的溫度，只有對于密封管管蓋安裝到位處于嚴(yán)格密封情況下，PCR實(shí)驗(yàn)防蒸發(fā)才能落到實(shí)處。

       不能簡單地認(rèn)為，單純依靠PCR儀熱蓋加持，PCR體系蒸發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)就高枕無憂。實(shí)際操作中，由于缺少上樣支架保護(hù)、密封管蓋安裝位置參差不齊等，反應(yīng)結(jié)束后PCR管變形、管蓋變形和爆管等現(xiàn)象屢見不鮮。

       因此，再優(yōu)良的熱蓋壓力調(diào)節(jié)設(shè)計(jì)功能，也無法替代手工和使用必要PCR密封工具對PCR樣品的精細(xì)密封及采用必要PCR反應(yīng)管支架，如96孔托盤-固定器組合支架（MicroAmp 96-Well Tray/Retainer Set），PCR管支架（Tube Support  Ring）等保護(hù)措施。

三、說說PCR管蓋密封神器

       通常，PCR單管、八聯(lián)排管可采用聯(lián)排管蓋密封，而PCR板則有粘性封板膜、PCR八聯(lián)排管蓋密封兩種選項(xiàng)。

       我們先看一款PCR管、八聯(lián)排管和PCR板通用的聯(lián)排管蓋密封操作工具——多功能聯(lián)排管蓋手柄（MicroAmp Cap Installing Tool）。

       該蓋管手柄長邊各有1個(gè)工作面，一面較平整，適用于平蓋；另一面分布有8個(gè)凹形杯（Recessed cup），專為圓頂蓋設(shè)計(jì)。對于圓凸形管蓋，使用時(shí)使將蓋管手柄凹形杯與凸蓋對齊，下壓管蓋即可輕松把管蓋壓入反應(yīng)孔中。

       之所以稱其為多功能手柄，是因?yàn)楣ぞ叩膬蓚€(gè)短邊也設(shè)置帶釘突、類似于推土機(jī)鏟的工作面。將小鏟上釘突插到八聯(lián)蓋管之間，即可將八聯(lián)蓋從反應(yīng)板、八聯(lián)排管上撬開，實(shí)現(xiàn)輕松開蓋，便于收集利用和檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

       賽默飛還提供了一塊PCR圓頂蓋上蓋工具(Cap-It Tool for domed cap strips)，從名字就可看出，這是專門針對圓凸形管蓋壓蓋用的手柄。

       伯樂為方便T100、S1000和C1000 touch PCR儀樣品密封和開蓋，也提供了2款小工具：PCR排管蓋管器（Strip Cap Tool）與PCR單管管蓋工具（Easy Cap Tool）。Strip Cap Tool只有2個(gè)工作面，分別用于平頂8聯(lián)排蓋和圓頂聯(lián)排蓋的批量壓蓋。而Easy Cap Tool為筆式，一次只能操作一個(gè)管蓋，圓頂、平頂蓋通用。它還帶有一個(gè)鱷魚嘴，可以卡住管蓋的邊緣，手部輕輕上抬即可輕松開啟管蓋。

參考文獻(xiàn)：

MiniAmp and MiniAmp Plus Thermal Cycler User Guide, Revision A.0

SimpliAmp Thermal Cycler User Guide, Revision C.0

ProFlex PCR System User Guide, Revision B.0

VeritiPro Thermal Cycler User Guide, Revision B.0

C1000 Touch Thermal Cycler Instruction Manual, Rev B

實(shí)時(shí)熒光定量PCR手冊