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赤橙黃綠青藍紫 誰持彩練當空舞——激酶活性HTRF檢測的熒光酶標儀方案-下
基于應用的多功能熒光酶標儀選型-3
（續(xù)：激酶活性HTRF檢測的熒光酶標儀解決方案-中）
三、HTRF檢測應用中多功能熒光酶標儀的選型要略
常規(guī)FI、TRF、FRET檢測，人們可能只關(guān)注到熒光酶標儀的激發(fā)、發(fā)射波長配置與測試要求契合的問題。而當了解HTRF標準流程后，對優(yōu)化熒光檢測條件的意義和其中涉及的技術(shù)要素之復雜，興許會有感悟。
開展HTRF測試前，實驗者首先須確認是否有可利用的HTRF認證多功能熒光酶標儀資源。
表2 Cisbio HTRF認證部分品牌多功能熒光酶標儀列表
Manufacturer | BMG | PerkinElmer | MD | BioTek | Tecan |
可供型號 | VantaStar FluoStar Omega PolarStar Omega ClarioStar Plus PheraStar FSX | EnVision XCite EnVision HTS | SpectraMax iD5 SpectraMax Paradigm SpectraMax i3x SpectraMax M5e Flexstation 3 | Synergy H1 Synergy NEO2 Cytation 1 Cytation 5 | Infinite F Nano+ Infinite F Plex Spark |
停產(chǎn)型號 | Clariostar Pherastar Plus Pherastar FS | / | SpectraMax i3 | Cytation 3 Synergy 4 Synergy H4 Synergy NEO Synergy 2 | Infinite F200 PRO Infinite F500 Infinite M1000 Infinite M1000 PRO Safire 2 |
(資料來源：PerkinElmer&Cisbio官網(wǎng)信息，入選時有刪減)
確認多功能熒光酶標儀屬HTRF認證型號后，還應核實是否配置有HRTF檢測規(guī)定的專用光學元件。不同品牌機型，制造商提供的HTRF功能組件有區(qū)別。
如VantaStar、Folarstar Omega、SpectraMax iD5、Synergy NEO2均須添加HTRF專用的具有Z軸調(diào)節(jié)功能的增強型時間分辨熒光模塊（Enhanced TRF module）、320/340nm紫外激發(fā)濾片、520/620/665nm發(fā)射熒光濾鏡這三件套。
相對而言，MD SpectraMax i3、SpectraMax Paradigm、SpectraMax i3x這三款熒光酶標儀，由于采用的是檢測功能模塊化設計，必要時直接將選配的HTRF檢測卡盒插入主機卡槽就可以啟動測試。實驗者無須為激發(fā)與發(fā)射濾光片的波長與帶寬、二向分色鏡截止波長范圍這類問題糾結(jié)。
為方便查詢，表3列出了部分品牌制造商的HTRF認證機型系統(tǒng)配置，可供參考。
表3 品牌多功能熒光酶標儀HTRF檢測所需配置
Brand | Instrument Model | HTRF Configurations |
MD | SpectraMax iD5 | HTRF Detection System (6590-0144), includes: Enhanced TRF module (0200-7030) Filter slides EX: 340nm BW 70nm (6590-0080) EM2: 520nm BW 15nm (6590-0098) EM1: 616nm BW 10nm (6590-0118) EM2: 665nm BW 10nm (6590-0121) |
SpectraMax Paradigm | Cisbio HTRF detection (0200-7011) , includes: Xenon light source 616nm EM1 filter 665nm EM2 filter | |
SpectraMax i3X | ||
BioTek | Synergy H1/H4 | HTRF europium/Red filter cubes (8040505): EX 330/80nm; EM1 620/10nm, EM2 665/8nm; Dichroic 365nm |
Synergy Cytation 1/3/5 | ||
Synergy NEO2 | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: HTRF-europium Excitation cubes(1035011): 330/80nm; Dichroic 365nm HTRF/Lance red Emission cubes (dual emission)(1035041): EM1 620/10nm, EM2 665/8nm; Dichroic 650nm 2) HTRF Europium/Green Kit, includes: HTRF terbium Excitation (1035012): 340/30nm; Dichroic 400nm HTRF green Emission cubes (dual emission)(1035049): EM1 520/10nm, EM2 620/10nm; Dichroic 550nm | |
BMG | VantaStar | ?1) HTRF Europium/Red Kit, includes: ?Advanced Optic Head with z-adjustment for TRF/TR-FRET Excitation filter：337nm (TR-Ex H)(001-337TR) Emission filter：620/8.5nm(001-615TR); 665/10nm(001-665TR) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Advanced Optic Head with z-adjustment for TRF/TR-FRET ?Excitation filter：337nm (TR-Ex H)(001-337TR) Emission filter：620/8.5nm(001-615TR); 520/10nm(001-520TR) |
Tecan | Infinite F Nano+ | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: ?Excitation filter：320/25nm (8C138) Emission filter：620/10nm;Dichroic 510nm(6F041) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: ?Excitation filter：320/25nm (8C138) Emission filter：665/8.5nm;Dichroic 510nm(9E336) |
nfinite F Plex | ||
Spark | ||
PE | EnVision XCite (TSM) | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: Excitation filter：UV2(TRF) 320 (#111) Emission filter：APC 665 (#205) 2nd emission filter：CY5 620 (#118) or 615 (#203) Top Mirror：TRF advanced single mirror (#615) or Lance/Delfia D400 single mirror (#412) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Excitation filter：TRF UV2 340 (#101) Emission filter：TRF 520(#275) or (#226) 2nd emission filter：495 (#276) for simultaneous readout Top Mirror：TRF advanced single mirror (#615) or Lance/Delfia D400 single mirror (#412) |
EnVision HTS (SDE) | 1) HTRF Europium/Red Kit, includes: Excitation filter：UV2(TRF) 320 (#111) Emission filter：APC 665 (#205) 2nd emission filter：CY5 620 (#118) or 615 (#203) Mirror：TRF Lance D407/D630 advanced dual mirror (#666) or Lance/Delfia D400/D630 dual mirror (#662) 2) HTRF Terbium/Green Kit, includes: Excitation filter：TRF UV2 340 (#101) Emission filter：TRF 520(#275) or (#226) 2nd emission filter：495 (#276) for simultaneous readout Top Mirror：TRF D407/D505 advanced dual mirror(#664) or D400/D505 dual mirror (#657) |
擁有HTRF認證資質(zhì)的熒光酶標儀、配套光學元件支持，再加上HTRF檢測試劑，開展HTRF技術(shù)研究方可謂萬事俱備、水到渠成。
四、HTRF檢測程序與同類TR-FRET方法間的兼容性
目前，同樣是基于TR-FRET技術(shù)開發(fā)的檢測試劑， HTRF之外還有MD IMAP Assays、BellBrook Transcreener assay 、Invitrogen LanthaScreen TR-FRET Kinase Assay、Bioauxilium Thunder Enhanced TR-FRET assay、PE Lance TR-FRET Assays等。
單論測試光譜數(shù)據(jù)，這些TR-FRET試劑的檢測光譜設置基本是通用的。那實際工作中，其他同類產(chǎn)品能否用HTRF的檢測標準程序測定？
分析結(jié)果是：不行。
表4 市面TR-FRET類試劑產(chǎn)品測試光譜特征
TR-FRET Assay | TRF Cage Type | Excitation | 2nd Emission | FRET Acceptor | 1st Emission |
HTRF-Eu/red assay | Europium cryptate | 320 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
HTRF-Tb/red assay | Terbium cryptate | 340 nm | 620 nm | XL665/d2 | 665 nm |
HTRF-Tb/green assay | Terbium Cryptate | 340 nm | 620 nm | Fluorescein/GFP | 520 nm |
LanthaScreen TR-FRET assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | AlexaFluor 647 | 665 nm |
LanthaScreen TR-FRET assay | Terbium Chelate | 340 nm | 490 nm | Fluorescein/GFP | 520 nm |
Transcreener TR-FRET assay | Terbium Chelate | 340 nm | 620 nm | HiLyte647 | 665 nm |
LANCE assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | ULight | 665 nm |
LANCE assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | Surelight APC | 665 nm |
THUNDER TR-FRET assay | Europium Chelate | 320 nm | 620 nm | Far-red dye | 665 nm |
PE-Cisbio強調(diào)的是，HTRF認證測試流程、方法的應用范圍嚴格限于HTRF試劑和技術(shù)使用，不適用于用于其他TR-FRET產(chǎn)品的測定。
TRF-FRET檢測具有時間高度靈敏的特性。在各種不同來源樣品測試條件下，不同TRF-FRET試劑盒的熒光光譜穩(wěn)定性、半衰期特征的差異，注定了檢測過程的積分時間、脈沖數(shù)量、時間延遲幾個關(guān)鍵參數(shù)難以完全匹配。盡管兩種試劑盒測定的激發(fā)波長、發(fā)射波長峰值特征一致，但不代表TRF-FRET過程中供體、受體兩種熒光信號的動力曲線相同。
HTRF試劑采用有大環(huán)結(jié)構(gòu)的穴狀態(tài)鑭系配合物，其光譜穩(wěn)定性優(yōu)異，與特殊優(yōu)化的緩沖液配合，可以實現(xiàn)0.6-1ms的超長熒光壽命。其他的TR-FRET技術(shù)中所用的鑭系配合物、FRET能量受體釋放的FRET熒光信號動力學特征除非能高度還原HTRF產(chǎn)品FRET過程的熒光表現(xiàn)。否則，在同一型號熒光酶標儀上用HTRF提供的標準測試程序測定其他廠商試劑，難免弄巧成拙、東施效顰。
表5 Ciosbio HTRF VS LanthaScreen檢測參數(shù)設置對比
Assays | Ciosbio HTRF-Eu/red Assay | LanthaScreen Eu Kinase Activity Assay |
Excitation filter | 337nm | Ex 340/30 nm |
Emission filter | 620/8.5nm，665/10nm | Em 665/10 nm，Em 620/10 nm; Dichroic LANCE/TRF |
Delay Time | 60 μs | 100 μs |
Integration Time | 400 μs | 200 μs |
對比Ciosbio HTRF-Eu/red Assay、LanthaScreen Eu Kinase Activity Assay在Perkin Elmer EnVision多功能熒光酶標儀上檢測所用的測試參數(shù)，可發(fā)現(xiàn)：盡管兩個試劑盒規(guī)定的激發(fā)波長、雙熒光發(fā)射波長設置基本一致（測試年份不同，同一型號儀器出廠預裝濾光片規(guī)格略有變動），但脈沖信號的積分時間延遲（HTRF-60μs VS LanthaScreen-100μs）、積分時間長度（HTRF-400μs VS LanthaScreen-200μs）的設定迥異。
這證實了我們分析的結(jié)論：不同TR-FRET試劑盒在熒光多功能酶標儀上的規(guī)定的測試條件設置存在較大區(qū)別，其標準檢測程序相互難以有效兼容。
表5的信息還表明：與Ciosbio HTRF-Eu比，LanthaScreen Europium激發(fā)的背景熒光衰減慢、而FRET供體和受體的熒光壽命短；LanthaScreen Eu檢測時間延遲拉長，極大地限制了檢測積分窗口的選擇余地和測試靈敏度的提升空間。
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