分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品用量少，核酸蛋白提取的產(chǎn)量有限。不要說(shuō)標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿（Cuvettes）最低測(cè)試樣品體積（Min. Volume）0.5mL、半微量比色皿（Semi-Microcell）動(dòng)輒0.10 - 0.25mL，即便是50 μL微量比色皿（Microcell），上樣體積也達(dá)到50 μL。對(duì)于常規(guī)10-25μL的PCR反應(yīng)體系，這樣的核酸樣品耗費(fèi)，顯然太過(guò)豪奢。撇開(kāi)標(biāo)準(zhǔn)10mm光程最高檢測(cè)濃度上限較低不談，對(duì)低豐度樣品稀釋至50 μL后，很可能超出標(biāo)準(zhǔn)10mm光程紫外吸光度最佳測(cè)試范圍，測(cè)試準(zhǔn)確性難以保障。因此，核酸蛋白測(cè)定體積的微量化成為分子生物實(shí)驗(yàn)的時(shí)代剛需。

       縱觀國(guó)內(nèi)外眾多微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)產(chǎn)品的技術(shù)特點(diǎn)，不難發(fā)現(xiàn)，在探索和實(shí)現(xiàn)樣品紫外微量化測(cè)定的風(fēng)塵中，依稀可見(jiàn)5個(gè)用自己方式追逐夢(mèng)想的身影。

一、Eppendorf BioPhotometer生物分光光度計(jì)

       1998年，隨著PCR實(shí)驗(yàn)日漸普及和實(shí)時(shí)熒光定量PCR商業(yè)化應(yīng)用，Eppendorf將從常規(guī)綜合型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中的核酸、蛋白及細(xì)胞測(cè)定等有關(guān)功能方法加以整合，率先推出了BioPhotometer生物分光光度計(jì)。                                              

       BioPhotometer對(duì)核酸蛋白按測(cè)定任務(wù)分門(mén)別類(lèi)予以細(xì)化、模塊化，并在儀器控制面板設(shè)置專(zhuān)門(mén)功能鍵。譬如核酸測(cè)定工作，面板上設(shè)置了dsDNA、ssDNA、RNA、Oligo四個(gè)快捷功能按鍵。蛋白測(cè)定直接細(xì)分為Protein 280nm、Bradford、BCA、Lowry法。實(shí)現(xiàn)了測(cè)定任務(wù)的一鍵直達(dá)。
        不僅如此，系統(tǒng)已預(yù)置了每項(xiàng)應(yīng)用程序的測(cè)試參數(shù)和條件，無(wú)需常規(guī)紫外應(yīng)用軟件復(fù)雜層疊菜單操作和設(shè)置，使得測(cè)試數(shù)據(jù)規(guī)范化，減少人為設(shè)置失誤。如雙鏈DNA樣品測(cè)定，系統(tǒng)自動(dòng)完成A260 nm以及額外的A230, A280和A340 nm共4個(gè)吸光度指標(biāo)測(cè)定報(bào)告，同時(shí)自動(dòng)顯示樣品濃度測(cè)定結(jié)果以及A260/280、A260/A230兩項(xiàng)核酸純度比值。
       BioPhotometer生物分光光度計(jì)的創(chuàng)造性設(shè)計(jì)，真不愧是同類(lèi)儀器的開(kāi)發(fā)者、實(shí)驗(yàn)研究人員的“導(dǎo)師”。

      Eppendorf在生物樣品測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域的另一個(gè)創(chuàng)新，是開(kāi)發(fā)出測(cè)試波長(zhǎng)范圍220 -1600nm的紫外可見(jiàn)通用型雙光程UVette比色皿。

       按照朗珀-比爾(Lambert-Beer)定律基本原理：同種物質(zhì)樣品溶液，濃度越高，Ia值越大；相同濃度樣品，測(cè)試光程b越大，Ia值越大；壓縮測(cè)試光程，Ia值減少。

       UVette為精巧的漏斗造型設(shè)計(jì)：底部為長(zhǎng)10mm×寬2mm×高2mm的狹長(zhǎng)形微量樣品槽（容積50μL），中部為漏斗部（總?cè)莘e500μL），上部為正常比色皿形狀（總?cè)莘e1mL）。

       采用兩種光程設(shè)計(jì)，既可以沿著底部狹槽的10mm的長(zhǎng)軸方向檢測(cè)，也可以將UVette旋轉(zhuǎn)90°使光束沿著2 mm短軸方向檢測(cè)。其優(yōu)勢(shì)在于：普通濃度范圍的樣品使用10 mm光程測(cè)定；高濃度樣品，用2mm短光程檢測(cè)，通過(guò)軟件算法自動(dòng)歸一化處理轉(zhuǎn)換為10mm測(cè)試值。

       實(shí)測(cè)中，約200mg臨床肥胖癥患者來(lái)源的脂肪組織提取總RNA（產(chǎn)量20-60μg），分別溶于30-50μL 含DEPC去離子水中制成原液。取1μL RNA原液用DEPC水按1:75比例稀釋后，移入U(xiǎn)vette，在Biophotometer分光光度計(jì)上進(jìn)行A260測(cè)定。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果表明，UVette微量比色皿測(cè)定性能滿足qPCR實(shí)驗(yàn)的總RNA樣品測(cè)定量要求。

二、日立UH5300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)

       標(biāo)準(zhǔn)光程比色皿，底面為10mm×10mm正方形，測(cè)試光束從比色皿正面距離底面8.5mm高度的中心位置垂直入射，光束中軸位置對(duì)應(yīng)的樣品體積為0.85μL，樣品體積須大于此容積方可進(jìn)行正常檢測(cè)。由于液面存在一定弧度的向下凹陷，為確保液面中心（最低處）位置高于測(cè)試光束，故實(shí)際測(cè)試樣品體積不少于1mL。

       要減少樣品體積，只能以測(cè)試光束在比色皿后壁的出射點(diǎn)為中心，X、Y、Z三個(gè)方向上同時(shí)縮減液體所占空間。

       測(cè)算表明，2mm寬×2 mm深×1 mm厚的液樣，容積為4μL。只有當(dāng)測(cè)試光束形成橫切面直徑1.0mm的圓形光斑或邊長(zhǎng)1.0mm×1.0mm正方形（對(duì)角線為1.44mm），才能實(shí)現(xiàn)最低1.5μL樣品完整包繞測(cè)試光束。

       世上無(wú)難事，只怕有心人。

       日立公司2013年上市的UH5300，就提供了一款痕量樣品池(trace sample cell)。該樣品池的光程僅1mm，可用于1.5 - 4μL樣品的測(cè)定。

       資料顯示，UH5300微量比色皿解決方案具有代表性：墊高微量檢測(cè)池架的位置，樣品溶液層厚度壓縮到1mm（壓縮了光程，可通過(guò)軟件算法校正為標(biāo)準(zhǔn)10mm光程的校正值）。

       考慮到加工難度和移液器加樣的可行性，1.5μL液量很可能已是這類(lèi)比色皿款式樣品池容積的下限。

       該檢測(cè)池須與池架底座(holder base，用于墊高檢測(cè)池架，使池內(nèi)液體的中心抬高與測(cè)試光束的中軸重合)、檢測(cè)池架 (single cell holder,比色皿架)和比色皿遮光罩(cell mask)一起使用。除非UH5300主要用于生物學(xué)微量樣品的測(cè)定，否則微量測(cè)定模塊與其他常量應(yīng)用測(cè)試模塊的更換，要耗費(fèi)功夫。

       此外，每個(gè)樣品測(cè)試前，樣品池都需經(jīng)自來(lái)水沖洗、去離子水沖洗、甩干或風(fēng)干后使用，操作之繁瑣，不言而喻。

三、AlphaSpec μL微量分光光度

       0.5-2.5μL量程移液器被常用于PCR實(shí)驗(yàn)中模板、引物的精密移取操作。

或許受此啟發(fā)，原美國(guó)Alpha Innotech公司于2008年開(kāi)發(fā)出了AlphaSpec μL微量紫外可見(jiàn)光度計(jì)（已停產(chǎn)）。它不用比色杯、毛細(xì)管，也無(wú)需將樣品滴加到檢測(cè)器表面。關(guān)鍵在AlphaSpec采用透射紫外的聚合物材料、結(jié)構(gòu)特殊設(shè)計(jì)的AlphaUV移液吸頭。

       這種吸頭上部與吉爾森P10移液器吸頭完全一致，但接觸樣品的底部為類(lèi)似USB接口的長(zhǎng)方體扁管（內(nèi)腔厚度1mm，相當(dāng)于1mm光程，有效容積2.5μL）。液體控制與常規(guī)移液器操作完全一致。

       檢測(cè)光束可以垂直穿透吸頭薄壁檢測(cè)樣品。操作時(shí)，移液器裝上AlphaUV吸頭后插如特制的檢測(cè)器接口，2秒鐘測(cè)試完成后，取下移液器并更換一新吸頭，可立即進(jìn)行下一個(gè)樣品測(cè)定。無(wú)須清潔測(cè)試端口樣品殘留，操作簡(jiǎn)便、高效。因此，特別AlphaSpec適合于樣品量極其有限，希望完成測(cè)試后可以回收樣品的研究工作。

 （待續(xù)）