Conical Centrifuge Tubes或Conical-bottom Centrifuge Bottles，因瓶體長度中近三分之一呈圓錐形，故稱作錐形離心瓶、尖底離心瓶。

       通常，組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中胰蛋白酶消化后的活細(xì)胞離心，分子生物實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌離心收獲（harvest）及大容量組織勻漿或細(xì)胞裂解液的澄清（clarifying）等常規(guī)中低速實(shí)驗(yàn)，依托臺(tái)式離心機(jī)即可實(shí)施操作。而錐形瓶因底部特殊造型，有利于樣品組分離心形成的顆粒物（pelleting）聚集分布在瓶底錐間一小塊區(qū)域，對(duì)最大程度收集沉淀或傾倒上清十分方便，因此深受實(shí)驗(yàn)人員喜愛。

       工作中我們注意到，對(duì)錐形離心瓶的使用，可能還存在一些認(rèn)識(shí)上的誤區(qū)，技術(shù)上也有亟待掃除的盲點(diǎn)。為此，本篇嘗試從離心機(jī)轉(zhuǎn)頭工作原理、錐形離心瓶外形特點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)應(yīng)用要求三個(gè)角度，探討錐形瓶在科研實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用方法這一問題。

一、錐形離心瓶的運(yùn)用是否不可替代？

       要澄清這一問題，需要從錐形離心瓶在水平轉(zhuǎn)頭和定角轉(zhuǎn)頭兩種離心模式下對(duì)其樣品組分沉淀生成原理加以具體分析。

       如圖1所示，當(dāng)采用水平轉(zhuǎn)頭離心時(shí)，樣品組分粒子在數(shù)百至數(shù)千倍重力的離心力作用下，克服液體的阻力水平方向發(fā)生沉降運(yùn)動(dòng)。大部粒子前進(jìn)、深入離心瓶錐體后，會(huì)遭遇瓶壁的阻擋。而此時(shí)，水平方向的離心力可人為分解成方向垂直于錐體側(cè)壁和平行于錐體的兩個(gè)分力。粒子沉降方向變化，將緊貼、沿著瓶壁向外側(cè)繼續(xù)遷移。這將使瓶底部樣品粒子密度激增，進(jìn)而粒子聚集形成有形顆粒而沉淀。

       在錐形瓶底的約束和強(qiáng)大的離心力作用下，沉淀顆粒向下、向外遷移而堆積集在錐頂一狹小區(qū)域內(nèi)。而在平底（Flat-Bottom）或圓底（Round-Bottom）離心瓶中，粒子可保持水平方向沉降直至瓶底，因此，沉淀顆粒物可散布至整個(gè)瓶底范圍。

       對(duì)于需要回收沉淀組分的應(yīng)用，如培養(yǎng)的酵母菌、細(xì)胞等，沉淀分布越集中，越利于完整回收，減少損耗。而對(duì)于細(xì)胞器制備中采集上清、去除死細(xì)胞及細(xì)胞碎片組分操作，平底瓶中沉淀過于分散，傾倒上清過程中往往容易有沉淀顆粒被液流蕩滌裹挾而混入。為避免沉淀污染而廢棄瓶底部分上清，必造成上清損失。因此，水平離心操作應(yīng)用中，采用錐形瓶有助于實(shí)現(xiàn)樣品高回收率。

       離心瓶若采用R10A5、JLA-10.500等固定傾角轉(zhuǎn)頭離心，則情況有所不同。

       如圖2所示，將兩種離心瓶置于具有26°傾角的角轉(zhuǎn)頭R10A5中離心時(shí)，在300×g RCF及更高RCF離心條件下，樣品顆粒形成后會(huì)趨向離心瓶的最大離心半徑處聚集。錐形和平底兩種離心瓶中生成的沉淀均呈局限性分布。

       理論上，轉(zhuǎn)頭傾角（通常為20°- 30°范圍）增大，則兩款離心瓶中沉淀斑的重心將靠近瓶壁、瓶底交界線，沉淀分布范圍擴(kuò)散。平底離心瓶的最大離心半徑處呈90°夾角，而錐形瓶相應(yīng)位置的瓶體夾角近135°。相同樣品離心條件下，平底離心瓶中沉淀斑塊要比錐形瓶內(nèi)的小且厚實(shí)。

       可見，錐形瓶無論是在水平轉(zhuǎn)頭、角轉(zhuǎn)頭中離心，都具有沉淀分布局限化的特點(diǎn)。但這并非錐形瓶的專利。將平底離心瓶置于角轉(zhuǎn)頭中工作時(shí)，也可產(chǎn)生與錐形瓶水平離心近似的分離效果。

二、錐形瓶主要適用于中低速離心？

       從病毒樣顆粒（Virus-Like Particles，eVLPs）、腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus, AAV）載體分離到干細(xì)胞的分離，從化合物抗菌活性研究到蛋白翻譯后修飾、染色質(zhì)相關(guān)蛋白復(fù)合物（protein components of chromatin associated complexes）分析等眾多科研實(shí)踐中，人們將錐形離心瓶用于細(xì)菌、酵母菌、sf9昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及模式生物秀麗隱桿線蟲的大規(guī)模培養(yǎng)后的收獲操作。

表1 品牌錐形離心瓶實(shí)驗(yàn)應(yīng)用報(bào)道舉隅

       資料表明，從大量的酵母菌、厭氧菌、大腸桿菌、秀麗隱桿線蟲、組織細(xì)胞及蛋白真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等起始材料中提取質(zhì)粒、細(xì)胞核、蛋白、病毒類顆粒時(shí)，大容量錐形離心瓶的使用可為操作提供極大方便。

       哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲離心操作常用RCF 200 - 2000×g的設(shè)定。培養(yǎng)菌體的收集時(shí)RCF設(shè)置以1800 - 3000×g居多。

但錐形離心瓶并非如只能進(jìn)行RCF 7000×g以下的中低速離心。根據(jù)文獻(xiàn)11報(bào)道，Corning 250mL錐形瓶（430776）在高達(dá)10000×g RCF條件下正常工作是可行的。事實(shí)上，Nalgene、Nunc等廠商為高速離心應(yīng)用提供了可耐受RCF 10000xg離心的錐形瓶。就文獻(xiàn)10和11實(shí)驗(yàn)應(yīng)用而言，條件許可時(shí)，采用Nalgene 3144-0175、3143-0175兩款175mL錐形離心瓶完全可行。

       因此，在大規(guī)模質(zhì)粒和蛋白提取、外泌體等細(xì)胞器的差速離心分離、噬菌體PEG分離等應(yīng)用中，大容量、高速錐形離心瓶的引入將給操作流程帶來事半功倍的效果。

三、錐形離心瓶運(yùn)用需面臨的問題

       錐形離心瓶下部為錐體造型，在瓶體外徑、帶蓋工作高度相同情況下，錐形瓶的有效容量低于常規(guī)平底離心瓶。將Corning 430776錐形離心瓶(250mL；59.7×161 mm)與Nalgene 3120-0250平底離心瓶（250mL；61.8×125.2 mm)、Corning 431841旋蓋離心瓶（250mL；60×128 mm）對(duì)比，一眼便知。

       而錐形瓶要扭轉(zhuǎn)容量上的相對(duì)劣勢，只能從增加瓶體的高度或（和）瓶體直徑這兩方面挖掘潛力。以500mL 的Corning 431123錐形離心瓶(95.5×146.8 mm)為例，其瓶身遠(yuǎn)比相同容量的Corning 431846密封蓋離心瓶(69×170 mm)、Nalgene 3120-9500離心瓶(69.5×158.9mm)粗，已達(dá)到1L Beckman C31597離心瓶（96×191mm)和Himac 1000PP廣口離心瓶(98×170mm)的體量。

       瓶體高度增加或直徑加大，使錐形瓶無法用于針對(duì)相同通量平底離心瓶尺寸設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)頭。事實(shí)是：

1）額定容量250mL的Nalgene或Corning錐形離心瓶，無法安裝到6×250mL角轉(zhuǎn)頭中離心；

2）無論是5804R離心機(jī)S-4-72水平轉(zhuǎn)頭，或5810R的A-4-62水平轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)頭配套的250mL離心瓶適配器只能承載Nunc 200mL （376813）、Falcon （352076）錐形瓶；

3）500mL 錐形瓶，不適用于4×500mL的A-4-81水平轉(zhuǎn)頭，只能在Multifuge-X4R pro的TX-1000或TX-750、5810R的S-4-104水平轉(zhuǎn)頭以及Avanti J-HC的JS-4.2等4×750mL及4×1000mL的大容量水平轉(zhuǎn)頭上使用。

因此，錐形離心瓶的使用不如平底離心瓶靈活，它對(duì)工作離心機(jī)配置資源是有技術(shù)門檻限制的。

四、錐形瓶離心運(yùn)用的離心機(jī)資源條件

       錐形離心瓶正常工作需要有工作容量可與之匹配的離心機(jī)、轉(zhuǎn)頭及錐形瓶相應(yīng)適配附件配置做支撐。

4.1 離心機(jī)主機(jī)平臺(tái)的性能要求

       若是常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞、菌體離心收獲或收集上清，轉(zhuǎn)頭Max RCF達(dá)到3000-4000×g能滿足操作要求，則配置4×250mL及更大容量水平轉(zhuǎn)頭的臺(tái)式離心機(jī)，即具備錐形離心瓶使用基礎(chǔ)條件。

表2 常用品牌錐形離心瓶工作RCF參數(shù)表

       文獻(xiàn)報(bào)道中常用的Falcon 175mL錐形瓶352076，外徑60.7mm，帶蓋總高度120.4 mm，可與多數(shù)主流品牌臺(tái)式離心機(jī)的4×250mL水平轉(zhuǎn)頭兼容。如Multifuge X1R Pro的TX-400轉(zhuǎn)頭（4×400mL/62×135 mm/4696×g）、eppendorf 5804R的S-4-72轉(zhuǎn)頭（4×250mL/62×130mm/3234×g）、Sigma 3-16K或3-18K的11180轉(zhuǎn)頭（4×400mL/62×139.2mm/4200×g)，Allegra X-30R配備的SX4250(4×250mL/61.6×125mm/3900×g)等，均具有支持Falcon 175mL錐形瓶離心的能力。

       若樣品離心力要求高（如RCF超過5000×g），雖然仍處于離心瓶的安全離心力限度范圍，但符合實(shí)驗(yàn)要求的臺(tái)式機(jī)轉(zhuǎn)頭稀缺。此時(shí)，Avanti J-E、Avanti JXN-26、Himac CR22N、Sorvall LYNX 4000等大容量立式離心機(jī)是較理想的解決方案。就Falcon 175mL錐形瓶而言，如立式離心機(jī)中的Avanti JXN-26的JLA-16.250角轉(zhuǎn)頭和JS-7.5水平轉(zhuǎn)頭（4×250mL/62×136mm/10400×g）、Avanti J-E或Avanti J-26S XP離心機(jī)的JLA-16.250角轉(zhuǎn)頭或JS-5.3 ALLSPIN水平轉(zhuǎn)頭（4×500mL/6670×g）、Himac CR22N的R14A、Sorvall RC-6 Plus的SLA-1500角轉(zhuǎn)頭都可作為資源選項(xiàng)。

4.2 轉(zhuǎn)頭工作容量的要求

       錐形離心瓶比同等容量的平底離心瓶要高，除去Falcon 352076、352075兩款錐形瓶，Corning 250mL錐形瓶、Nunc 200mL錐形瓶及Nalgene 175mL錐形瓶都均無法在目前在產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)6×250mL角轉(zhuǎn)頭中安裝，只能在6×500mL、4×1000mL、6×1000mL大容量角轉(zhuǎn)頭或工作容量4×500mL、4×750mL及4×1000mL水平轉(zhuǎn)頭中使用。

       這使得離心機(jī)常規(guī)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用定制的容量轉(zhuǎn)頭和配置方案，很可能無法滿足實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有錐形瓶運(yùn)行要求。如Mutifuge X4R Pro離心機(jī)的F14-6x250LE角轉(zhuǎn)頭(6×250mL;62×125 mm)、eppendorf 5804R的S-4-72水平轉(zhuǎn)頭（4×250mL; 62×130 mm），5810R的A-4-62水平轉(zhuǎn)頭（4×250mL;62×136 mm）等，都面臨這一問題。

4.3 錐形瓶適配附件的要求

       錐形離心瓶無論在何種轉(zhuǎn)頭上使用，均須用離心機(jī)轉(zhuǎn)頭配套錐形瓶專用適配器或離心瓶制造商提供的離心瓶適配器（centrifuge Bottle adapter）或瓶墊（centrifuge Tube cushion，Bottle insert，Bottle cushion）墊于瓶底。

       不同離心機(jī)制造商、轉(zhuǎn)頭可提供的配套適配件功能類型不盡一致。

       錐形瓶與轉(zhuǎn)頭可有兩種工作組合模式。

       一種是角轉(zhuǎn)頭常用的圓底瓶適配器+錐形瓶墊+錐形瓶模式。此模式是先在角轉(zhuǎn)頭離心孔底安裝平底離心瓶適配器，適配器上方疊放錐形瓶墊，最后將離心瓶安裝在瓶墊上。250mL錐形瓶在Avanti JXN-26立式離心機(jī)JLA-10.500角轉(zhuǎn)頭（含362750適配器）、Himac CR22N離心機(jī)R10A5角轉(zhuǎn)頭和Sorvall LYNX 6000 F12-6x500LEX角轉(zhuǎn)頭（含010-0152適配器）上離心，均屬于這種模式。

       第二種是水平轉(zhuǎn)頭用的離心瓶+錐形瓶專用適配器模式。這就需安裝離心機(jī)制造商專門為錐形瓶量身定制的錐形瓶適配器。專用錐形適配器的外部與平底離心瓶底部尺寸一致，可與轉(zhuǎn)頭離心孔底部緊密貼合。其內(nèi)面為錐形，與錐形瓶底部嚴(yán)絲合縫。Multifuge X4R Pro離心機(jī)的TX-1000和eppendorf 5810R的S-4-104轉(zhuǎn)頭，均自帶Corning 500mL錐形瓶適配器。將此適配器在吊籃中安裝就位后將錐形瓶插入適配器即可，無需使用Corning 500mL錐形瓶墊431124即可實(shí)現(xiàn)安全離心。TX-1000轉(zhuǎn)頭還可提供另一款適配器75005392，用于62×145mm尺寸瓶體，可兼容250mL Corning 錐形離心瓶、200mL Nunc 錐形瓶及175mL Nalgene錐形瓶。

4.4 錐形瓶高度范圍的要求

       業(yè)內(nèi)所標(biāo)注的錐形瓶高度通常指的是離心瓶合蓋后總高度。不同品牌、型號(hào)和容量的錐形瓶高度存在差別。

表3 品牌錐形離心瓶外形尺寸表

       實(shí)驗(yàn)者更應(yīng)關(guān)注離心瓶的工作高度參數(shù)。

       錐形離心瓶的工作高度是指離心瓶與瓶墊或轉(zhuǎn)頭的錐形適配器組合后的總高度。通常，瓶-墊組合體的高度比離心瓶高度多出5-10mm。評(píng)估錐形離心瓶與工作轉(zhuǎn)頭時(shí)匹配程度時(shí)，瓶墊的增高作用不可忽略。

       不同品牌、型號(hào)轉(zhuǎn)頭適用的離心瓶高度范圍不一。

       錐形瓶的瓶蓋高近2.5cm，而直徑約為瓶體直徑的一半。手指捏緊瓶蓋即可輕松完成樣品瓶在角轉(zhuǎn)頭或水平吊籃適配中的裝卸。故錐形瓶的瓶體高度低于轉(zhuǎn)頭建議標(biāo)高，并不妨礙離心操作。
       但瓶體工作高度超標(biāo)情況則大為不同。忽視轉(zhuǎn)頭可接受的離心瓶工作高度上限強(qiáng)行上樣，輕則影響轉(zhuǎn)頭蓋或吊籃密封蓋的正確安裝，重則在轉(zhuǎn)頭啟動(dòng)、吊籃向內(nèi)側(cè)擺過程中，瓶蓋與轉(zhuǎn)頭軛部（Yoke）接觸而極易引發(fā)離心安全事故。
       因此，錐形瓶瓶體高度應(yīng)秉持“從低不從高”的原則。

       無論哪種離心瓶與轉(zhuǎn)頭屬工作組合，錐形瓶離心操作只有在與離心機(jī)管理員、技術(shù)服務(wù)人員確認(rèn)設(shè)備配置符合特定錐形瓶工作條件時(shí)方可進(jìn)行。

五、結(jié)語

       大容量錐形離心瓶的特殊外形設(shè)計(jì)，無論是用于角轉(zhuǎn)頭還是水平轉(zhuǎn)頭中工作，離心生成沉淀的分布集中，既方便傾盡上清又便于完整回收沉淀。RCF5000×g以內(nèi)的中低速離心應(yīng)用環(huán)境中，采用Corning、Falcon錐形瓶比常規(guī)平底離心瓶的成本優(yōu)勢更顯著，且簡便易行。

       而當(dāng)錐形瓶用于細(xì)胞器差速離心分離、大規(guī)模質(zhì)粒提取純化、噬菌體提取等高達(dá)RCF 10000×g以上的離心實(shí)驗(yàn)時(shí)，需有立式大容量高速離心機(jī)、500mL-1L角轉(zhuǎn)頭及配套適配器支持，雖分離效果與平底離心瓶趨近，但操作較為繁瑣。

       文獻(xiàn)10研究項(xiàng)目中，實(shí)驗(yàn)者用Avanti J-E落地離心機(jī)的JLA-16.250（或JA-14）角轉(zhuǎn)頭，在250mL平底離心瓶以15000×g RCF工作轉(zhuǎn)速實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)菌體碎片的有效分離。這驗(yàn)證了本文開頭的論點(diǎn)：角轉(zhuǎn)頭中離心時(shí)，平底離心瓶具有與錐形瓶同等離心效果。

參考文獻(xiàn)

［1］Arthur Colson, Christophe Louis Depoix, Corinne Hubinont, et al. Isolation of Primary Cytotrophoblasts From Human Placenta at Term. Bio Protoc. 2021; 11(19): e4185.

［2］Ryoko Inaki, Yoshihiko Sato, Daisuke Nakamura, et al. Lipoaspirate stored at a constant low temperature by electric control suppresses intracellular metabolism and maintains high cell viability. Regen Ther. 2023; 24: 662–669.

［3］Jianlong Wang, Alan B. Cantor, Stuart H. Orkin. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes in Mouse Embryonic Stem Cells Using In Vivo Biotinylation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2009; CHAPTER: Unit1B.5.

［4］James P. Shellhammer, Elizabeth Morin-Kensicki, Jacob P. Matson, et al.   Amino acid metabolites that regulate G protein signaling during osmotic stress. PLoS Genet. 2017; 13(5): e1006829.

［5］Grant C Weaver, Rina F Villar, Masaru Kanekiyo, et al. In vitro Reconstitution of B Cell Receptor Antigen Interactions to Evaluate Potential Vaccine Candidates. Nat Protoc. 2016; 11(2): 193–213.

［6］Andrew B. Kleist, Francis Peterson, Robert C. Tyler, et al. Solution NMR spectroscopy of GPCRs: residue-specific labeling strategies with a focus on 13C-methyl methionine-labeling of the atypical chemokine receptor ACKR3. Methods Cell Biol. 2019; 149: 259–288.

［7］Vladimir N Noskov, Ray-Yuan Chuang, Daniel G Gibson, et al. Isolation of circular yeast artificial chromosomes for synthetic biology and functional genomics studies. Nat Protoc. 2011; 6(1): 89–96.

［8］Smaranda Craciun, Emily P. Balskus. Microbial conversion of choline to trimethylamine requires a glycyl radical enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109(52): 21307–21312.

［9］Gregory A. Phelps, Martin N. Cheramie, Dinesh M. Fernando, et al.  Development of 2nd generation aminomethyl spectinomycins that overcome native efflux in Mycobacterium abscessus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024; 121(2): e2314101120.

［10］Aftabul Haque, Nicholas K. Tonks. Use of Phage Display to Generate Conformation-Sensor Recombinant Antibodies. Nat Protoc. 2012; 7(12): 2127–2143.

［11］Jeffrey M. Schaub, Chia-Wei Chou, Hung-Che Kuo, et al. Expression and characterization of SARS-CoV-2 spike proteins. Nat Protoc. 2021; 16(11): 5339–5356.

［12］Sean M. Crosson, Peter Dib, J. Kennon Smith, et al.Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018; 10: 1–7.