（前續(xù)：Optima Max-xp超速離心機轉(zhuǎn)頭的選擇對外泌體分離效果影響的分析）

       用差速離離心方法從不同功能狀態(tài)活細胞群來源的細胞外囊泡群中分離外泌體，是常用的的外泌體分離方法。差速離心的實現(xiàn)依賴于樣品顆粒的沉降屬性。在設定的RCF環(huán)境下，離心機轉(zhuǎn)頭內(nèi)部RCF分布不均衡，多數(shù)情況下，離心沉淀組分中，均不止直徑40-150nm的外泌體，往往還夾雜直徑100-300nm的其它EVs組分。離心沉淀中組分構成不同，是導致不同研究數(shù)據(jù)差異的重要原因。不同離心時間，樣品管內(nèi)不同大小、組成、密度的顆粒發(fā)生共沉淀難以有效避免。研究表明，沉淀物中外泌體和脫落囊泡比例、非囊泡類生物大分子的構成比例有時間依賴性。
目前，對外泌體的發(fā)生起源、功能作用尚處于探索階段。超速離心時間的設定，在實踐中尚無嚴格統(tǒng)一標準。而超速離心時間選擇，不僅關乎實驗結(jié)果的可重復性，還對整體實驗工作進程有直接影響。我們有必要來探討外泌體分離流程中的超速離心時間如何設置這一復雜問題。

1、外泌體分離中影響時間設定的轉(zhuǎn)頭因素

       樣品離心沉淀所需時間（沉降時間）主要由樣品組分在特定條件下的沉降系數(shù)、工作轉(zhuǎn)速和特定轉(zhuǎn)頭的Rmax與Rmin比值三個因素決定。用公式可表述為： 

T_s = (1/S) ? (1/ω² ) ? ln(R_max/R_min)  ······················································· (9)

       規(guī)定K因子值的定義后，公式(9)可轉(zhuǎn)變?yōu)椋?/span>

T_s = k/S   ······················································································· ·················· (10)

       樣品組分的沉降屬性與自身密度、溶液溫度和粘度有關。高濃度蔗糖溶液、添加血清的培養(yǎng)基環(huán)境下，細胞外囊泡、細胞器沉降速度會降低。

       公式(10)表明：在樣品條件相同情況下，離心時間長短與所用轉(zhuǎn)頭的k因子值大小有關。K因子小，沉降時間短；K因子值大，沉降時間長。
有研究證實：水平轉(zhuǎn)頭之間，根據(jù)轉(zhuǎn)頭各自有效k因子值的對比關系來優(yōu)化調(diào)整有效離心時間，可取得較一致的分離結(jié)果。但此方法不適用于角轉(zhuǎn)頭之間離心時間的調(diào)整。
       外泌體超速分離中，為確保溶液中樣品回收率同時兼顧離心工作效率，運用轉(zhuǎn)頭K因子值與沉降時間的關系原理，調(diào)整離有效離心時間是意義的：對R_min較小的轉(zhuǎn)頭宜適度延長離心時間；若采用相同離心時間設置，則可嘗試將R_min小的轉(zhuǎn)頭宜適度提高RCF值，如從100000×g調(diào)整為110000×g。
       以單管容量均為39mL的MLA-50與Type 70 Ti兩個轉(zhuǎn)頭為例：Type 70 Ti的R_min和RCF_min大、K因子值小，故分離效能高于MLA-50。如參考方案是Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭100000×g下離心70分鐘設置，則多半采用快速升降速模式設置。要用MLA-50轉(zhuǎn)頭來替代則離心時間應適度延長。反之，若參考方案為MLA-50轉(zhuǎn)頭，而采用Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭進行，則延長離心時間不必延長。
       離心時間設置，不能僅考慮樣品組分有效沉降時間，還須結(jié)合實際所用轉(zhuǎn)頭升降速過程占用時間的差別。

        轉(zhuǎn)頭運行時間分為啟動加速、穩(wěn)定運行和剎車減速三個階段。而樣品有效沉降時間只相當于剔除加速、減速兩個階段后轉(zhuǎn)頭持續(xù)穩(wěn)定在設定轉(zhuǎn)速或RCF狀態(tài)運行的時間。超速離心的設定時間，除了樣品所需的有效沉降時間，還需將轉(zhuǎn)頭加減速階段耗費時長納入考慮。即：超速離心設定時間要大于樣品沉降所需時長。
        不同型號超速轉(zhuǎn)頭的自重不同、空載與滿載情況下，轉(zhuǎn)頭加減速過程所需時間不同。轉(zhuǎn)頭負重大，加減速耗時長。此外，設定的工作轉(zhuǎn)速高，加減速耗時長，則設定離心時間要相應延長（見表7）。

表7  Beckman Optima臺式、立式超離轉(zhuǎn)頭滿載情況下加速、減速時長列表

（工作轉(zhuǎn)速值參考離心力-轉(zhuǎn)速在線換算工具https://novopro.cn/tools/g-force-rpm-convertion.html計算結(jié)果得出）。

       數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)頭滿載并以最快速度加減速時，多數(shù)轉(zhuǎn)頭加速慢而減速快。
       但最快升降速模式并不適用于所有轉(zhuǎn)頭類型、離心管、樣品載量和應用方法。無論角轉(zhuǎn)頭或水平轉(zhuǎn)頭，使用無蓋開口管且樣品滿載狀態(tài)下，啟動和剎車宜盡量平緩以避免啟動剎車過猛引發(fā)樣品外溢損失。而用垂直轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭和角轉(zhuǎn)頭密度梯度離心，平緩減速或轉(zhuǎn)頭自由減速，可避免已完成分離梯度液層混合風險。

       Beckman超離心內(nèi)置有超平穩(wěn)控制功能（Ultra Harmonic Technology, UHT），是通過內(nèi)置UHT程序控制轉(zhuǎn)頭升降速的速度變化曲線。以Optima MAX-XP為例，加減速過程設置有10檔升、11檔降的UHT控制程序可選（見表8）。

表8 Acceleration and Deceleration Rates

       加速ACCEL控制程序分別用數(shù)字1-9和無數(shù)字表示共10檔，而減速DECEL控制程序分為0-9和無數(shù)字共11檔。超速離心的加減速過程控制各分為兩個階段：0-5000rpn階段和5000rpm – 設定轉(zhuǎn)速階段。無論升速、降速，5000rpm-工作轉(zhuǎn)速階段，系統(tǒng)均以系統(tǒng)默認的最快速度進行不受人工干預。而0-5000rpn低速階段，則由ACCEL\DECEL程序調(diào)控。數(shù)字代碼從1至9，轉(zhuǎn)頭升降速的時間以30秒-1分幅度遞增。1檔較短，9檔最長。0檔為自由落體式減速耗時超過10分鐘。不輸入檔位代碼數(shù)字，則轉(zhuǎn)頭從0-設定轉(zhuǎn)速的全過程均以最快變速完成升降速過程。

       數(shù)據(jù)表明，僅0-5000rpm這一過程一升一降兩個階段各取中位數(shù)累計時間就長達5分半鐘。再將5000rpm至設定工作轉(zhuǎn)速（如設定為30000rpm）最快變速階段時間，則升降速過程耗時至少在7分鐘以上。這一點從表7提供的轉(zhuǎn)頭升降速時間看，實際超過10分鐘。

       因此，為確保樣品有效離心時間不低于60分鐘，“基礎流程1”建議在滿足100000×g RCF的條件下超離時間設置為60+N分鐘，N值大小對應的正是轉(zhuǎn)頭的加減速時長。

2、外泌體超速分離流程中離心時間設置存在的爭議
        在已報道的63個實例中，27例的時間設置為70-90分鐘，多達16例的設置為120分鐘，3例為3小時，還有1例是4小時的設置。其中，轉(zhuǎn)頭型號可查實的37例中，所用轉(zhuǎn)頭與時間設置情況見表9。表中編號213、229、106、273的不同實驗，工作溫度、緩沖液、轉(zhuǎn)頭（TLA-100.3）、主機和RCF設置都相同，而離心時間竟出現(xiàn)了120 min、240 min、60 min和70 min四種設置。

表9 部分文獻中外泌體超速離心時間設置與轉(zhuǎn)頭工作參數(shù)表

       表中相同RCF設置下，離心時間60--120min不等的現(xiàn)象極為常見。可見，關于離心時間設置問題，學界并無一致意見。

       不同實驗項目中，造成離心時間差異懸殊，是由實驗樣品本身和外部離心條件的內(nèi)外因綜合作用的結(jié)果。

       首先是外因方面，不同型號轉(zhuǎn)頭、相同RCF設置下分離效能存在區(qū)別是不爭的事實(見表10)。單管樣品容量均為39mL的5款轉(zhuǎn)頭TYPE 70 Ti、TYPE 50.2 Ti、VTi 50.1、SW 32 Ti和SW 28之間，在相同118000×g的RCF設定下，離心效能最高是VTi 50.1，其次是TYPE 70 Ti、TYPE 50.2，水平轉(zhuǎn)頭SW 28墊底。若TYPE 70 Ti有效離心時間為60分鐘，從k因子值大小這一常識即可推定SW 32 Ti和SW 28連個水平轉(zhuǎn)頭有效離心時間遠超60分鐘。

表10 不同類型轉(zhuǎn)頭在118000×g RCF設定下轉(zhuǎn)速-K因子值-沉降時間表

       具體實驗中，如SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭4小時離心時間收獲的樣品組分與TYPE 70 Ti轉(zhuǎn)頭70分鐘、VTi 50.1離心50分鐘外泌體產(chǎn)量達到了相同分析效果是極為正常的。另外，衡量外泌體產(chǎn)量的所用方法同樣十分關鍵。提取離心沉淀中總RNA含量用Bioanalyzer 2100檢測而非實時熒光定量PCR方法，其測試數(shù)據(jù)特異性存疑。Western Blot無法區(qū)分體積較大的細胞外囊泡、凋亡體、外泌體以及死亡細胞解體所釋放的TSG101蛋白。

       “基礎流程1”提到了離心3個小時無損外泌體囊泡結(jié)構。所謂過猶不及，離心時間并非越長越好。延長離心時間，將使富含蛋白質(zhì)的囊泡顆粒及可溶性蛋白質(zhì)等非囊泡類組分的聚集沉淀，加劇外泌體中蛋白污染程度。對此，目前學界的看法是有共識的。因此，外泌體含量評價方法存在缺陷情況下界定的外泌體產(chǎn)量，不足為據(jù)。

      其次，外泌體的分泌是一動態(tài)過程，它與細胞自身功能狀態(tài)、培養(yǎng)基中自帶外泌體排空以及培養(yǎng)條件密切相關。不同實驗所用細胞自身活性、功能狀態(tài)以及培養(yǎng)處理條件的差別，造成細胞外泌體的分泌效率存在區(qū)別。若無細胞生理功能狀態(tài)特定指標的支持，僅憑培養(yǎng)基中細胞數(shù)量基數(shù)評估外泌體提取產(chǎn)量，結(jié)果值得商榷。

       不應輕易得出外泌體分離時間以4小時之內(nèi)為宜，70分鐘離心時間無法分離出外泌體無效的結(jié)論。

       特定 RCF設置下外泌體離心時間、囊泡直徑大小截止范圍（cut-off）的技術工具的出現(xiàn)以及大量文獻實例證據(jù)，都不足以支持70分鐘離心時間無效的觀點。

3、外泌體超速分離離心時間的設置原則與方法
       關于外泌體超速離心分離流程細節(jié)信息的匯報，MISEV2018指南除了要求披露實驗所用轉(zhuǎn)頭型號、樣品管、RCF設置、k因子有效值、離心時間和離心溫度等要素，還需提供轉(zhuǎn)頭加減速設置參數(shù)。可見，離心時間設置離不開所用的樣品體積、轉(zhuǎn)頭工作性能條件。
       轉(zhuǎn)頭的選擇需要遵循兩個原則：
1）研究對象相似
       不同來源樣本材料、不同生理病理狀態(tài)下的細胞分泌的外泌體種類、數(shù)量存在差異。因此，從初始樣品材料相同或相近的外泌體研究參考文獻中，篩選出對超速離心流程的離心時間、RCF設置、溫度和轉(zhuǎn)頭型號、離心管貨號及轉(zhuǎn)頭加減速信息披露完整的實例，摘錄其實驗參數(shù)條件。其中，離心時間、RCF設置和轉(zhuǎn)頭型號信息必不可少。
2）轉(zhuǎn)頭性能相近
       當轉(zhuǎn)頭型號與參考方案中不一致時，按轉(zhuǎn)頭型號——類型——樣品容量的優(yōu)先順序，選擇與參考轉(zhuǎn)頭效能匹配的超離轉(zhuǎn)頭。
       外泌體超速分離實驗中，不可脫離自身條件，簡單照搬參考文獻的時間參數(shù)設置。這不僅浪費資源和時間，還可能危及外泌體分離結(jié)果。工作參數(shù)優(yōu)化調(diào)整方法，可參考《Optima MAX-XP超速離心機轉(zhuǎn)頭的選擇對外泌體分離效果影響的分析》中“根據(jù)轉(zhuǎn)頭工作效能確定外泌體超速離心分離解決方案”一節(jié)內(nèi)容。
       工作參數(shù)的調(diào)整有兩個途徑。一是優(yōu)化離心時間，二是優(yōu)化RCF設置。
       當RCF值明確后，為確保樣品回收率和離心效率，對R_min小的轉(zhuǎn)頭宜適度延長離心時間。以Optima MAX-XP臺式超速離心機用的MLA-50與Optima XE -90立式超離用Type 70 Ti為例。雖然均為單管容量39mL的角轉(zhuǎn)頭，但相同RCF設置下，Type 70 Ti具有較大R_min、RCF_min和較小K因子值，其分離效能高于MLA-50。如參考方案為Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下100000xg離心70分鐘設置，用MLA-50轉(zhuǎn)頭替代時，離心時間適當延長是必要的。反之，若參考對象是MLA-50，而實驗者用Type 70 Ti，則延長離心時間意義不大。
       外泌體分離的品質(zhì)與轉(zhuǎn)頭內(nèi)部RCF分布有關。為確保離心管內(nèi)RCF條件接近，考慮到MLA-50和Type 70 Ti之間R_min的巨大差異，單純用相同RCF設置不夠，還應考慮將MLA-50轉(zhuǎn)頭RCF_min調(diào)整至與Type 79 Ti相近的水平。計算表明，Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭若設定為100000xg RCF，則將MLA-50轉(zhuǎn)頭的RCF設置提升至123600×g后，兩個轉(zhuǎn)頭中離心管的中上部位RCF的分布條件比較接近，有助于獲得與Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭接近的分離效果。

(后續(xù)：臺式超速離心機Optima Max-XP在外泌體分離操作細節(jié)匯報中應注意的問題)