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從PubMed數(shù)據(jù)看Beckman超速離心機(jī)Type 45Ti轉(zhuǎn)頭的配置與應(yīng)用——蛋白的分離
Beckman Optima XPN 100/90/80、Optima XE 90/80立式超速離心機(jī)通用的Type 45 Ti鈦合金材質(zhì)定角轉(zhuǎn)頭,額定工作容量6×94mL,是除Type 19角轉(zhuǎn)頭(6×250mL,19000rpm)外,單管處理量最大的超速轉(zhuǎn)頭。其實(shí)驗(yàn)應(yīng)用公開報(bào)道, 最早見于1978年澳大利亞費(fèi)爾菲爾德傳染病醫(yī)院病毒研究人員從甲型肝炎患者糞便中分離甲肝病毒的實(shí)驗(yàn)。
截止至2023年9月30日, 從PubMed期刊數(shù)據(jù)庫(kù)中共采集到Beckman超速離心機(jī)Type 45Ti轉(zhuǎn)頭有關(guān)實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)336篇。從論文發(fā)表時(shí)間看, 1978 - 2003年為轉(zhuǎn)頭應(yīng)用的低谷徘徊期, 2004年起,實(shí)驗(yàn)應(yīng)用及產(chǎn)出進(jìn)入快速增長(zhǎng)期。2004 - 2023這20年, 實(shí)驗(yàn)論文數(shù)量出現(xiàn)指數(shù)級(jí)躍升。若以5年為一統(tǒng)計(jì)周期,則2019 - 2023年刊文數(shù)量是前40年論文總數(shù)的1.6倍之多(見圖1)。
尤其值得關(guān)注的是,2014-2023這10年總計(jì)有286篇研究報(bào)告發(fā)表。所發(fā)期刊的2023年IFoid 分值(參考https://sci.justscience.cn/查詢數(shù)據(jù))8.0分以上者達(dá)117篇。其中,包括一大批在Nature、Cell、Science、Nat Methods、Cell Discov、Nat Microbiol和Protein Cell等期刊發(fā)表的高水平論文(見表1)。
表1. Type 45Ti轉(zhuǎn)頭有關(guān)部分實(shí)驗(yàn)應(yīng)用刊文統(tǒng)計(jì)(2019.01-2023.09)
期刊名稱 | Type 45Ti應(yīng)用刊文數(shù)量 | IFoid-2023分值 |
Nature | 5 | 64.8001 |
Cell | 4 | 64.5 |
Science | 2 | 56.8978 |
Nat Methods | 1 | 47.9984 |
Cell Discov | 1 | 33.5015 |
Nat Microbiol | 1 | 28.3001 |
Protein Cell | 1 | 21.1001 |
Bioact Mater | 1 | 18.9 |
ACS Nano | 2 | 17.1 |
Nat Struct Mol Biol | 1 | 16.8008 |
Nat Commun | 18 | 16.6009 |
Mol Cell | 3 | 16 |
J Extracell Vesicles | 16 | 15.9992 |
Adv Sci (Weinh) | 2 | 15.1 |
Nucleic Acids Res | 1 | 14.9 |
Nat Protoc | 1 | 14.8 |
Nat Chem Biol | 1 | 14.8 |
Alzheimers Dement (N Y) | 1 | 14 |
Sci Adv | 6 | 13.6006 |
Exp Mol Med | 1 | 12.8 |
Theranostics | 1 | 12.4002 |
Mol Ther | 1 | 12.4 |
Dev Cell | 1 | 11.8 |
EMBO J | 2 | 11.4 |
J Exp Clin Cancer Res | 2 | 11.3 |
Proc Natl Acad Sci U S A. | 6 | 11.1 |
ISME J | 1 | 11 |
Food Hydrocoll | 1 | 10.7 |
這其間高水平研究論文的占比之高,不免會(huì)引起人們的好奇與思考:如許之多有重大學(xué)術(shù)價(jià)值和廣泛影響力的研究項(xiàng)目中, 到底使用Type 45Ti轉(zhuǎn)頭分離何種實(shí)驗(yàn)對(duì)象?
對(duì)上述117個(gè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的相關(guān)內(nèi)容歸類統(tǒng)計(jì)顯示:Type 45Ti轉(zhuǎn)頭的應(yīng)用對(duì)象主要包括蛋白質(zhì)(59例)、細(xì)胞外囊泡(EVs,44例) 和核糖體(8例)。此外,微粒體和脂質(zhì)等其它亞細(xì)胞組分、病毒類(慢病毒載體、甲病毒屬Getah病毒)應(yīng)用實(shí)例占比均低于2%(見圖2)。
為此, 我們圍繞蛋白質(zhì)、細(xì)胞外囊泡(EVs)和核糖體分離有關(guān)應(yīng)用實(shí)例進(jìn)行了考察, 以了解超速離心機(jī)Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭在其中所扮演的角色。
一、Type 45Ti轉(zhuǎn)頭在蛋白分離純化中的應(yīng)用
與Beckman Type 45Ti轉(zhuǎn)頭應(yīng)用有關(guān)實(shí)例共計(jì)59例(BioRxiv平臺(tái)發(fā)表文章因IFloid無(wú)法查詢,不納入統(tǒng)計(jì)范圍)的蛋白研究存在多個(gè)維度。從蛋白在生命活動(dòng)中的功能分,包括了細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、微管運(yùn)輸、胞內(nèi)囊泡生物發(fā)生及轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白的翻譯-加工修飾-折疊及定位、蛋白復(fù)合體組裝及變構(gòu)、RNA轉(zhuǎn)錄和剪輯、DNA損傷修復(fù)和DNA轉(zhuǎn)座、細(xì)胞壁合成等細(xì)胞全流程生命活動(dòng)。從蛋白分布定位看,有膜信號(hào)識(shí)別受體(如GPCRs)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,陽(yáng)離子選擇性通道等各種膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道、核糖體新生鏈復(fù)合物(RNCs)等。
雖然不同實(shí)驗(yàn)所研究對(duì)象從真核生物(哺乳動(dòng)物、果蠅)、原核生物(金黃色葡萄球菌、乳酸桿菌、恥垢分枝桿菌M. smegmatis等)、擬南芥、病毒(HIV-1, 噬菌體等)、螺旋體、瘧原蟲到DNA馬達(dá)各不相同,但研究思路、方法路線相似。無(wú)論是蛋白復(fù)合體組裝、配體-受體識(shí)別、蛋白與蛋白分子或蛋白-核酸結(jié)合、抗生素作用機(jī)制或細(xì)菌耐藥機(jī)制等,無(wú)不基于對(duì)蛋白分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析及與配體結(jié)合后構(gòu)象改變進(jìn)行的。統(tǒng)計(jì)顯示,上述59個(gè)研究項(xiàng)目中的36個(gè)項(xiàng)目的核心方法是用冷凍電鏡技術(shù)(Cryo-EM)對(duì)蛋白分子進(jìn)行了3D活性構(gòu)象的高分辨率分析。其余23個(gè)例是用X-ray晶體分析、電子顯微鏡技術(shù)、熒光偏振技術(shù)、單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移(single-molecule fluorescence resonance energy transfer,smFRET)技術(shù)等方法完成蛋白功能效應(yīng)與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的分析(Structure-based mechanism)。
蛋白組分制備技術(shù)有兩種途徑:一種是從豬腦、雞肝等動(dòng)物組織器官中直接提??;第二種,也是最主要的途徑,是從細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一種或兩種異源表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行分離純化。異源表達(dá)體系中使用最多的是原核表達(dá)系統(tǒng)是E. coli BL21 (DE3),占比44%,沙門氏菌、乳酸桿菌用的較少。真核類表達(dá)系統(tǒng)中,昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)10例占比17%(依次是Sf9、Hi5和Sf21),其次是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中HEK293細(xì)胞系(10.1%)、酵母表達(dá)系統(tǒng)(8.5%)等。
1. 代表性蛋白研究應(yīng)用實(shí)例
實(shí)例1 膜蛋白(受體)的提?。↗oshua A. Lees, 2023)
藥物作用靶向位點(diǎn)、細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞,大多是通過生物膜上的特殊膜受體蛋白實(shí)現(xiàn)的。約50%臨床藥物的靶向分子為膜蛋白。生物膜上的受體蛋白的表達(dá)豐度一般較低,直接在天然生物環(huán)境中難以提取到足量蛋白。由于蛋白質(zhì)翻譯后還需經(jīng)過修飾包括糖基化,脂肪酰化和磷酸化等修飾才能正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)以及與胞膜整合和定位。異源表達(dá)的受體蛋白或存在錯(cuò)誤修飾、折疊導(dǎo)致而不具備生物活性,或表達(dá)效率不夠高效。此外,膜蛋白疏水性強(qiáng),實(shí)驗(yàn)條件下難以維持膜蛋白正確構(gòu)象,使得對(duì)膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的解析相對(duì)滯后。
G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是真核生物中最大的膜蛋白超家族,分為A類視紫紅質(zhì)樣受體(Rhodopsin-like receptor)、B 類分泌素受體家族(Secretin receptor family)、C類代謝型谷氨酸受體(mGlu receptor)、D 類真菌交配信息素受體(Fungal mating pheromone receptor)、E 類 cAMP環(huán)腺苷酸受體(Cyclic AMP receptor)和F類卷曲蛋白受體 (Frizzled receptor, FZD)六大類。GPCR是由7個(gè)跨膜螺旋、胞外N端、胞內(nèi)C端、3個(gè)胞外環(huán)和3個(gè)胞內(nèi)環(huán)的保守結(jié)構(gòu)組成。胞外區(qū)域在結(jié)合激動(dòng)性信號(hào)分子(如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子)后,受體構(gòu)象發(fā)生變化,受體胞內(nèi)區(qū)域招募并與G蛋白、P-arrestin等效應(yīng)蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)以及激素等特異性配體結(jié)合,通過環(huán)腺苷酸(cAMP)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路和鈣離子信號(hào)通路等調(diào)節(jié)體內(nèi)生理活動(dòng)。
孤兒受體(orphan GPCR,oGPCR)屬A類GPCR,因其內(nèi)源性配體尚未發(fā)現(xiàn)而得名。由于配體信息和配體結(jié)合靶點(diǎn)不明確,且孤兒受體與結(jié)構(gòu)已知GPCR同源程度較低,使得對(duì)孤兒受體的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究受阻。
GPR61是一種與食欲相關(guān)的孤兒受體,是治療代謝和體重障礙的藥物靶標(biāo)。通過構(gòu)建N末端活性構(gòu)象(hGPR61-dnGαs/iN18)和非活性構(gòu)象(hGPR61ICL3BRIL)的重組蛋白進(jìn)行人GPR61的結(jié)構(gòu)表征,是對(duì)GPR61的選擇性小分子反向激動(dòng)劑的結(jié)合位點(diǎn)和受體-配體相互作用方式研究的基礎(chǔ)。
用于冷凍電鏡研究的孤兒受體GPR61構(gòu)建體表達(dá)蛋白的純化流程大致包括以下步驟:
【異源表達(dá)系統(tǒng)準(zhǔn)備】
人GPR61在活性構(gòu)象中的表達(dá)構(gòu)建體(hGPR61-dnGαs / iN18)和非活性構(gòu)象(hGPR61ICL3BRIL)的重組構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化為DH10Bac E. coli感受態(tài)細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒DNA,將其轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞中以產(chǎn)生P0病毒。通過在無(wú)血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(SF-900 III)中以2×106活細(xì)胞/ ml的密度和0.5的MOI感染1L的Sf-9細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。感染后當(dāng)細(xì)胞的活力為80-85%時(shí)收獲細(xì)胞。
【細(xì)胞膜制備】
收集培養(yǎng)的Sf-9細(xì)胞沉淀,在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水中室溫孵育30分鐘,添加無(wú)EDTA的羅氏cOmplete蛋白酶抑制劑片劑后, 4℃下孵育30分鐘;
將細(xì)胞用高壓均質(zhì)機(jī)M-110L 15kPsi裂解細(xì)胞;
將細(xì)胞裂解物在Type 45 Ti角轉(zhuǎn)子中235000 ×g離心45分鐘,收集沉淀;
將沉淀重懸于500mM NaCl,50mM HEPES/pH 7.5中,添加無(wú)EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑后重復(fù)上一步超速離心操作,收集沉淀;
【蛋白分離】
將沉淀重懸于含有150mM NaCl,50mM HEPES/pH 7.5,10%甘油的低鹽緩沖液中,添加無(wú)EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑;
將粗膜提取液與1%月桂基麥芽糖新戊二醇(LMNG,Anatrace)和0.2%膽固醇半琥珀酸三鹽(CHS,Anatrace)溶解在500mM NaCl和50mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP中,添加無(wú)EDTA的Roche完全蛋白酶抑制劑片劑,孵育90分鐘;
【層析純化】
超速離心澄清裂解液,上樣值抗FLAG M2親和凝膠層析柱,4℃下孵育2小時(shí);
用緩沖液(500mM NaCl,50mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP,0.5%LMNG和0.01%CHS)洗滌FLAG樹脂柱兩次;
使用緩沖液(0.25 mg/ml FLAG、0.01% LMNG、0.002% CHS、150mM NaCl、50mM HEPES/pH 7.5、100μM TCEP)洗脫;
將洗脫餾分合并,在離心過濾濃縮器中濃縮;
用含有0.001%LMNG,0.0002%CHS,150mM NaCl,25mM HEPES/pH 7.5,100μM TCEP的緩沖液在Superose 6尺寸排阻層析柱(SEC)上純化;
用SDS-PAGE分析餾分,收集合并單體GPR61對(duì)應(yīng)餾分。
實(shí)例2 從豬腦中純化動(dòng)力蛋白激活蛋白(dynactin)(Sami Chaaban, 2022)
【組織準(zhǔn)備】
采集新鮮豬大腦,置于冰冷PBS中運(yùn)輸;
將2個(gè)大腦(約200g)用冰冷PBS沖洗2遍,手動(dòng)去除腦干和主要血管后,用HB緩沖液(35mM PIPES-KOH/pH 7.2, 1mM MgSO4, 0.2mM EGTA,0.1mM EDTA,1mM DTT)再次沖洗腦組織;
【組織裂解】
將大腦置于添加有3片無(wú)EDTA蛋白酶抑制劑片和1.3mM PMSF的230mL HB緩沖液中,用Waring均質(zhì)器以均質(zhì)15秒-停頓15秒的方式進(jìn)行4個(gè)循環(huán)裂解組織細(xì)胞;
裂解物用JLA-16.250高速角轉(zhuǎn)頭16000rpm離心15min;
【蛋白分離】
上清液用Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下45000rpm離心50分鐘,棄沉淀;
【層析純化】
在玻璃纖維過濾器和0.45μm過濾器中過濾上清液后,加載到250mL SP-Sepharose強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析柱上。柱預(yù)先經(jīng)AKTA Pure SP緩沖液(35mM PIPES/pH 7.2, 5mM MgSO4, 1mM EGTA, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mM ATP)平衡;
用含3mM KCl的SP緩沖液洗滌色譜柱后,以3倍柱體積250mM KCl的線性梯度洗脫。收集15 mS/cm附近的峰并用0.22μm過濾器過濾;
濾液加至用MonoQ緩沖液(35mM PIPES, 5mM MgSO4, 100μM EGTA, 50μM EDTA, 1mM DTT, pH 7.2)預(yù)平衡的MonoQ 16/10強(qiáng)陰離子交換層析柱上。用MonoQ緩沖液洗柱后,先以1倍柱體積的150mM KCl的線性梯度洗脫,再以10倍柱體積的350mM KCl的線性梯度洗脫。將39 mS/cm附近的洗脫峰餾分合并濃縮至3 mg/mL;
洗脫液轉(zhuǎn)移至用添加有5mM DTT、0.1mM ATP的GF150緩沖液洗(25mM HEPES/pH 7.2, 150mM KCl, 1mM MgCl2)預(yù)平衡的TSKgel G4000SWXL凝膠過濾柱上,將114 mL處的峰合并濃縮至3 mg/mL,分成3μL等分,用液氮速凍后-80℃儲(chǔ)存。
實(shí)例3 金黃色葡萄球菌耐藥機(jī)制研究(J. Andrew N. Alexander, 2023)
耐甲氧西林抗生素的金黃色葡萄球菌簡(jiǎn)稱金葡菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)對(duì)絕大部分β-內(nèi)酰胺類(β-lactamase)抗生素具有耐藥性。耐藥機(jī)制由Bla基因調(diào)控系統(tǒng)(由編碼β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)基因BlaZ、啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因BlaR1和轉(zhuǎn)錄抑制因子基因BlaⅠ組成)和MecA調(diào)控系統(tǒng)(由青霉素結(jié)合蛋白PBP2a的結(jié)構(gòu)基因MecA、上游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因MecR1和轉(zhuǎn)錄抑制因子基因MecⅠ組成)介導(dǎo)。兩套耐藥基因系統(tǒng)同源(BlaR1和MecR1基因序列35%一致;BlaI和MecI序列61%相同), 且轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式相同。
BlaR1和MecR1均為跨膜蛋白胞外部分為感受器結(jié)構(gòu)域, 含有青霉素結(jié)合位點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)為金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域, 具有裂解Blal及Mecl的功能。當(dāng)β-內(nèi)酰胺類抗生素等誘導(dǎo)劑結(jié)合到BlaR1的感受器結(jié)構(gòu)域, BlaR1被激活, 其胞內(nèi)鋅金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變, 水解抑制蛋白BlaⅠ水解并使之脫離BlaZ的啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn), BlaZ基因轉(zhuǎn)錄抑制解除, 表達(dá)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶, 導(dǎo)致對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素出現(xiàn)耐藥性。與此類似,MecI抑制因子通常結(jié)合在MecA基因的啟動(dòng)子部位。在β-內(nèi)酰胺類藥物的作用下, MecR1被激活, 構(gòu)象改變, 誘導(dǎo)對(duì)MecⅠ蛋白水解并從啟動(dòng)子上脫落, MecA基因得以表達(dá)合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶點(diǎn)——合蛋白(penicillin-binding protein, PBPs) PBP2a。因PBP2a與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力極低, 對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物不敏感。而其所具有PBPs的完成細(xì)菌細(xì)胞壁合成功能, 卻能確保在抗生素作用下細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的完整性。
Bla調(diào)控系統(tǒng)可以調(diào)控MecA基因的表達(dá), 并且可在數(shù)分鐘內(nèi)誘導(dǎo)PBP2a的產(chǎn)生。而MecA調(diào)控系統(tǒng)從激活到PBP2a合成則需要數(shù)小時(shí)之久。因此, Bla調(diào)控系統(tǒng)在許多MRSA菌株廣譜抗生素耐藥性方面作用至關(guān)重要。
研究還發(fā)現(xiàn), BlaR1無(wú)需其他組分參與可直接自發(fā)切割BlaI(spontaneous autocleavage)啟動(dòng)抗生素耐藥性機(jī)制。
冷凍電鏡數(shù)據(jù)表明, 耐藥性BlaR1野生型與其F284A突變體(可有效結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗生素狀態(tài))為異質(zhì)二聚體穿膜結(jié)構(gòu)。N端的鋅指金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域在胞內(nèi), C端的可結(jié)合β-內(nèi)酰胺的感受結(jié)構(gòu)域位于胞外側(cè)。兩個(gè)單體間通過胞質(zhì)側(cè)的α9螺旋結(jié)構(gòu)連接。胞外β-內(nèi)酰胺的感受結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)單體胞外部分EL1相互作用。提示了BlaR1蛋白野生型胞外結(jié)構(gòu)域與β-內(nèi)酰胺類藥物抗生素間還存在活性位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性排斥作用。
研究表明, BlaR1中Ser283和Phe284間存在自切割環(huán)(autocleavage loop), 這個(gè)曲環(huán)通常占據(jù)胞內(nèi)鋅金屬蛋白酶活性位點(diǎn)(F284A突變體中的自切環(huán)部位結(jié)構(gòu)完整, 而野生型結(jié)構(gòu)中該自切環(huán)存在未切割和切割兩種狀態(tài))。自切割環(huán)卡位阻礙了鋅指金屬酶對(duì)BlaI、MecI轉(zhuǎn)錄抑制因子的水解, 而BlaI的二聚物狀態(tài)可穩(wěn)定結(jié)合在啟動(dòng)子上。當(dāng)β-內(nèi)酰胺結(jié)合到BlaR1胞外側(cè)的感受結(jié)構(gòu)域時(shí), 感受結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)酶活性結(jié)構(gòu)域均向細(xì)胞壁靠近和構(gòu)象的變化, 使自切環(huán)脫離鋅指蛋白酶活性位點(diǎn)。此活性位點(diǎn)的暴露方便了BlaI結(jié)合和水解, 耐藥基因表達(dá)抑制弱化, β-內(nèi)酰胺耐藥基因表達(dá)的增加,產(chǎn)生耐藥效應(yīng)。
該研究項(xiàng)目中,針對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物受體蛋白BlaR1的cryo-EM分析和蛋白測(cè)序應(yīng)用,分別采用了兩種制備流程。
1)氨芐青霉素誘導(dǎo)下BlaR1構(gòu)象的cryo-EM分析
【菌體準(zhǔn)備】
4℃下離心收集菌體, 并重懸于添加了5mg/mL溶菌酶和20μg/mL DNase I的裂解緩沖液(150mM NaCl, 50mM HEPES/pH 7.5)中, 37℃攪拌、孵育1小時(shí);
裂解液冰浴冷卻后,用高壓均質(zhì)器25000 psi下裂解菌體;
將裂解物以18600×g離心30分鐘;
【細(xì)胞膜制備】
上清液用Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心1小時(shí), 棄上清收集沉淀;
【膜蛋白分離】
用Dounce均質(zhì)器將膜沉淀重懸于添加1%(w/v)DDM的裂解緩沖液中,孵育1小時(shí)以提取膜;
用Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心45 min后, 棄沉淀(不溶膜組分),收集上清;
上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾后, 添加咪唑至濃度20 mM/pH 7.5;
【層析純化】
裝入經(jīng)平衡緩沖液處理的His-Trap HP層析柱中,分別用15mL的20mM、100mM咪唑緩沖液A各洗滌一次后, 用325 mM咪唑緩沖液A進(jìn)行洗脫;
洗脫餾分用填充Sephadex G-25脫鹽柱在緩沖液A中進(jìn)行脫鹽處理;
用離心濃縮器(100 kDa NMWL)濃縮;
【氨芐青霉素誘導(dǎo)變構(gòu)處理】
用BioComp梯度大師配制輕重兩組甘油梯度緩沖液:輕緩沖液組成包括5%(v/v)甘油, 150mM NaCl, 20mM HEPES/pH 7.5加或不加0.01% LMNG洗滌劑;重甘油梯度緩沖液組成包括 25%(v/v)甘油, 150mM NaCl, 20mM HEPES/pH 7.5;
對(duì)于氨芐青霉素處理樣品, 將BlaR1(F284A)在1 mM氨芐青霉素冰上孵育約15 min, 然后用250μM氨芐西林制備所有后續(xù)緩沖液;
將150-250μL的蛋白質(zhì)樣品添加于甘油梯度層上, 用SW 55 Ti水平轉(zhuǎn)頭4℃、55000 rpm離心8小時(shí),用BioComp梯度分餾儀收集梯度餾分;
各餾分用Amicon Ultra (100?kDa NMWL)過濾器4℃下6000×g濃縮;
濃縮后蛋白組分收集于緩沖B(150?mM NaCl, 20?mM HEPES/pH?7.5)中, 用Micro Bio-Spin P-30進(jìn)行脫鹽處理。
2)BlaR1自切割環(huán)位點(diǎn)Edmann端測(cè)序用BlaI蛋白純化
【異源表達(dá)系統(tǒng)準(zhǔn)備】
將一個(gè)BlaI-麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合結(jié)構(gòu)克隆到BlaI的C端, 并具有Gly-Ser-Ser連接子。N-端用10xHis 標(biāo)簽設(shè)計(jì)BlaI-MBP結(jié)構(gòu), 克隆到pGEX-6P-1表達(dá)質(zhì)粒中, 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DE3)細(xì)胞。DE細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約0.6 - 0.8時(shí),用IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)蛋白并將培養(yǎng)溫度降低至20℃,過夜后收集菌體;
菌體在緩沖液3A(25mM Tris/pH 8.0和100mM NaCl)中裂解;
【膜蛋白分離】
細(xì)胞裂解液用Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭4℃、40000rpm離心45 min;
【層析純化】
上清用0.45μm過濾器過濾后,添加咪唑至10mM濃度, 轉(zhuǎn)移至經(jīng)緩沖液3A中平衡的1mL His-Trap HP親和層析柱;
用10倍柱體積、濃度2%的緩沖液3B(50?mM Tris/pH?8.0, 500?mM imidazole, 100?mM NaCl)洗柱后, 以1ml/min流速用0-100%梯度洗脫;
洗脫組分用Amicon Ultra(30 kDa NMWL)的離心過濾器濃縮;
上樣至經(jīng)緩沖液3C(25mM Tris/pH 8.0,100mM NaCl)平衡處理的Superdex 75 10/300凝膠層析柱完成蛋白純化。
2. 蛋白分離中Type 45 Ti的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
資料顯示,超速離心是保持蛋白活性構(gòu)象提取分離的必由之路。從操作流程上看, 無(wú)論取材于天然組織,或源于異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白,初始組織勻漿、細(xì)胞裂解液體積往往較大。對(duì)于疏水性的膜蛋白組分,往往需經(jīng)歷大容量低速離心收集細(xì)胞—細(xì)胞裂解液高速離心澄清—裂解上清或沉淀重懸液的超速離心分離的過程。而MBP融合蛋白、dynactin等可溶性蛋白組分,大體積裂解液直接上樣到Type 45 Ti轉(zhuǎn)頭,只需一步操作即可將蛋白與EVs、細(xì)胞器和細(xì)胞碎片分離,獲得蛋白的粗提溶液。因此,Type 45 Ti角轉(zhuǎn)頭超速離心功能和較大的容量,正好可以大有作為。
不同蛋白理化屬性、下游應(yīng)用(如cryo-EM分析與Edmann測(cè)序分析)對(duì)樣品品質(zhì)要求雖有不同,但對(duì)于提取緩沖液,首先用Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭超速離心沉淀處理是一致的基礎(chǔ)步驟。與核糖體、病毒類樣品分離不同,密度梯度離心環(huán)節(jié)在蛋白的提取分離中并非必須步驟。
統(tǒng)計(jì)表明, 同時(shí)使用角轉(zhuǎn)頭沉淀、水平轉(zhuǎn)頭密度梯度離心兩步分離的報(bào)道實(shí)例占比約1/3。先用單管容量較大的Type 45Ti角轉(zhuǎn)頭將可提取溶液上清中蛋白組分沉淀,再將沉淀轉(zhuǎn)移至容量相對(duì)較小的水平轉(zhuǎn)頭進(jìn)行密度梯度分級(jí)。水平轉(zhuǎn)頭中,最常用的是容量6×38.5mL的SW 28或SW 32 Ti, 其次是容量6×13.2mL的SW 41 Ti、SW 40 Ti 或SW 32.1 Ti (6×17mL)。用容量較小的SW 60 Ti (6×4.0mL)進(jìn)行純化也有報(bào)道。蛋白組分密度梯度離心使用較多的梯度介質(zhì)是蔗糖。密度梯度離心耗時(shí)往往長(zhǎng)達(dá)15-18小時(shí), 對(duì)實(shí)驗(yàn)操作、工作效率都是一種挑戰(zhàn)。因此,大多數(shù)報(bào)道實(shí)例中,采用的是2-3種蛋白層析柱組合的辦法取代密度梯度離心實(shí)施提取液中蛋白的純化分離。