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生物醫(yī)學(xué)樣品微量紫外光度測定的技術(shù)原理和方法-下

 (續(xù):生物醫(yī)學(xué)樣品微量紫外光度測定的技術(shù)原理和方法-中)

五、Implen NanoPhotometer液滴壓縮技術(shù)

       通常,低鹽樣品(脫鹽后的蛋白溶液)、非極性溶劑、去污劑(如SDS、Triton X100)殘留或樣品溫度升高,均可導(dǎo)致液體表面張力顯著降低。依賴液體表面張力維持樣品的測試光路穩(wěn)定的方法,很容易因溶液張力特征變化而致液柱拉伸失敗,造成測試誤差或難以獲得有效數(shù)據(jù)。特別是純化后的蛋白質(zhì)樣品,表面張力低同時基質(zhì)成分復(fù)雜,微量蛋白質(zhì)的可靠測量向來都是充滿挑戰(zhàn)的任務(wù)。

       德國Implen公司是業(yè)內(nèi)微量紫外可見光度計領(lǐng)域僅次于NanoDrop的著名廠商。所開發(fā)的NanoPhotometer系列微量紫外可見光度計全部采用的是由鉸鏈可開合密封上蓋和可控制升降的樣品基座組成的密封性檢測池。上蓋正中為石英玻璃反光鏡,基座中央為石英玻璃光學(xué)測試窗。樣品滴加到檢測窗口,測試光束從底座的測試窗向上穿過樣品后抵達(dá)頂蓋,被反光鏡反射后折回,再次通過樣品、測試窗口進(jìn)入檢測器。上下兩個石英表面間距的2倍即測試光程的長度。微量測定功能的核心原理是獨特的液滴樣品壓縮技術(shù)(Sample Compression Technology)。

       所謂樣品壓縮技術(shù)是指:測試液滴添加到檢測池中測試窗口,放下密封上蓋后,液滴夾在基座、頂蓋反光鏡之間被擠壓成薄膜。膜的形成是測試表面對液體的物理擠壓所致,與液體自身的表面張力屬性無關(guān),徹底擺脫測試光路對表面張力的依賴。而薄膜厚度可由底座的升降運動來控制,調(diào)整基座高度即可控制膜的厚度,即實現(xiàn)對測試光程的調(diào)節(jié)。                                              

Implen NanoPhotometer N80 N60 N50微量紫外可見光度計技術(shù)原理圖.jpg

       Implen采用兩個固定的錨點來定義路徑長度(True Path控制技術(shù))。如圖所示,基座在錨點1時,基座-鏡面間距大,測試光路徑長?;A粼阱^點2時,基座-鏡面間距縮小,液滴更趨扁平,此時測試路徑較短?;涤纱盆F控制只能在兩個固定錨點之一定位,無法在除兩個錨點之外的任何位置停留。這樣確保了測試光程的精確設(shè)定,而不發(fā)生漂移。

       NanoPhotometer微量紫外可見光度計還為核酸和蛋白質(zhì)的測定引入了自動光程設(shè)定功能(Automatic Path Length Setting):通常,先在較長光程下測量,根據(jù)測得的樣品吸光度,判定樣品是否在路徑長度的有效線性范圍內(nèi)。如樣品濃度超出該范圍,儀器將自動以較短的路徑長度重新測量。系統(tǒng)自動選擇適宜光程,確保測量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Implen NanoPhotometer微量紫外可見光度計測試光程表

型號

N120

NP80

N60

N50

光程長度選項

1.0 mm/0.125 mm

0.67 mm/0.07 mm

0.67 mm/0.07 mm

0.67 mm/0.07 mm

最小上樣體積

2.0 μL

0.3 μL

0.3 μL

0.3 μL

濃度測定區(qū)間

dsDNA:2 - 8000 ng/μL;

BSA:0.06 - 230 mg/mL

dsDNA:1 - 16500 ng/μL;

BSA:0.03 - 478 mg/mL

dsDNA:1 - 16500 ng/μL;

BSA:0.03 – 478 mg/mL

dsDNA:5-7500 ng/μL;

BSA:0.15 – 217 mg/mL

 

六、其他微量紫外光度測定技術(shù)和方法

6.1 NanoPhotometer測定原理類似技術(shù)

       德國Hellma公司的Traycell 2.0,是專為紫外可見分光光度計標(biāo)準(zhǔn)檢測池架開發(fā)的、可用于微量核酸蛋白樣本測定的石英比色皿。

       將樣品滴加到比色皿頂部的光學(xué)窗口,上蓋,與配套比色皿適配器組合后,安裝到標(biāo)準(zhǔn)檢測池架即可。測試完成,簡單擦拭比色皿光學(xué)窗口和上蓋,即可進(jìn)行下一個樣品的測定。使用方法上,與NanoDrop One/One C、Implen NanoPhotometer NP80/60/50系列微量紫外可見光度計如出一轍。加樣和清理樣品殘留時,無需從檢測池架上取出TrayCell比色皿,比色皿與測試光束的相對位置始終保持不變,以測試結(jié)果的可重復(fù)性。

Hellma Traycell 2.0微量比色皿使用方法.jpg

       TrayCell比色皿由主體部分(相當(dāng)于NanoPhotometer的樣品基座)、帶反射鏡的密封蓋組成。主體部分嵌入光纖,用于傳導(dǎo)測試光束和接收樣品檢測的信號。因此,其工作原理、結(jié)構(gòu)設(shè)計與Implen NanoPhotometer頗有相似之處。

Hellma Traycell 2.0微量比色皿測試技術(shù)原理.jpg

       測定前,比色皿需要一定的準(zhǔn)備操作:

       通常情況下或預(yù)估樣品濃度較低時,首先用1.0mm的光程測定。選擇較薄的適配器(安裝到比色皿底部)和數(shù)字標(biāo)示為10的上蓋(測定吸光度值相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)10mm比色皿測定值之1/10,相當(dāng)于樣品進(jìn)行了10倍稀釋);

       測定濃度較高的樣品時,直接采用0.2mm光程方案測定,選擇安裝較厚的適配器和標(biāo)示50的上蓋(表明其稀釋因子為1:50)。

       測試光程(即樣品層厚?。┎煌枳畹蜆悠敷w積存在一定差別:0.2mm光程的TrayCell容量為0.7 - 4μL,1mm光程的TrayCell樣本容量為3 - 5μL。

       給比色皿添加適配器,在eppendorf BioSpectrometer 系列分光光度計的microcell、日立UH5300紫外微量測定模塊使用中,都是規(guī)定動作。

 

6.2 NanoDrop測定原理類似技術(shù)

       這類產(chǎn)品首推eppendorf開發(fā)的Cuvette G1.0微量比色皿。

       G1.0由鋁外殼和帶疏水性涂層的石英玻璃夾層制成,光路長度1 mm,測定樣品體積范圍1.5–10μL,主要涉及用于高濃度核酸和蛋白質(zhì)樣品的檢測。

eppendorf Cuvette G1.0微量比色皿使用方法.jpg

 

       G1.0的測定原理、點樣操作與NanoDrop OneC類似,都是借助測定界面的疏水作用和液體表面張力維持液柱和測試光路的穩(wěn)定,光束與液柱法中軸重合、穿透樣品層后進(jìn)入檢測器完成測試。每個樣品測試結(jié)束,簡單擦拭檢測窗口清理。

       Cuvette G1.0與TrayCell兩種比色皿均直接安裝于標(biāo)準(zhǔn)10mm光程檢測池架上使用。G1.0點樣時須從檢測模塊上取下,在桌面完成移液后,重新插回檢測池中。但G1.0上樣前無須適配器安裝,操作更簡便。Cuvette G1.0的售價與國產(chǎn)Nano 400這類固定波長的微量紫外可見光度計整機(jī)價格旗鼓相當(dāng)。但若Hellma TrayCell比, G1.0收的智商稅還算有點良心。

 

參考文獻(xiàn):

[1]Eppendorf μCuvette G1.0 Operating instructions

[2]Instructions for use UVette universal adapter

[3]Model Uh5300 Spectrophotometer Instruction Manual (Edition 1)

[4]NanoPhotometer N120/NP80/N60/N50/C40 User Manual (Version 4.3.3)

[5]NanoDrop One Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Revision E)

[6]NanoVue Plus Product User Manual (REV 1.4)

[7]Traycell 2.0 Quick Start Guide