可能原因及解決方案

一、DNA模板

1、完整性較差

建議方法：

1）在分離DNA時(shí)，盡量減少對(duì)DNA的切斷或切刻。如有需要，可通過(guò) 凝膠電泳檢測(cè)模板DNA完整性。

2）將DNA保存于 分子級(jí)別的水 或 TE緩沖液 （pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。

2、低純度

建議方法：

    1）使用純化試劑盒分離模板DNA時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵循試劑盒生產(chǎn)商的建議。查閱用戶(hù)手冊(cè)和疑難問(wèn)題指南，改善較低的DNA質(zhì)量。

2）如果采用化學(xué)或酶促DNA純化方案，應(yīng)確保無(wú)PCR抑制劑殘留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。

3）使用70%乙醇再純化或沉淀和洗滌DNA，去除可能會(huì)抑制DNA聚合酶的殘留鹽分或離子（如， K+, Na+等）。

4)選擇具有 高合成能力的DNA聚合酶，這類(lèi)聚合酶對(duì)土壤、血液和植物組織攜帶的常見(jiàn)PCR抑制劑具有較好的耐受性。

3、用量不足

建議方法：

1)檢查 DNA起始量 ，如有需要適當(dāng)增加起始量。

2)選擇具有 高靈敏度 的DNA聚合酶用于擴(kuò)增。

3)適當(dāng)增加PCR循環(huán)數(shù)。

4、復(fù)雜的目的片段（如，高GC含量或含二級(jí)結(jié)構(gòu)）

建議方法：

   1)選擇具有 高合成能力的DNA聚合酶，這類(lèi)酶對(duì)DNA模板的親和力較高，更適合擴(kuò)增困難靶標(biāo)。

2)使用 PCR添加劑或輔助溶劑 ，促進(jìn)富含GC的DNA和具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列變性。

3)增加 變性時(shí)間或溫度 ，從而高效解離雙鏈DNA模板。

5、長(zhǎng)片段

建議方法：

1)確認(rèn)所選DNA聚合酶的長(zhǎng)片段擴(kuò)增能力。使用專(zhuān)為 長(zhǎng)片段PCR設(shè)計(jì)的DNA聚合酶。

2)選擇具有 高合成能力的DNA聚合酶，這類(lèi)酶能夠在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增長(zhǎng)片段。

3)降低退火和延伸溫度，促進(jìn)引物結(jié)合和提高酶熱穩(wěn)定性。

4)根據(jù)擴(kuò)增子長(zhǎng)度，增加延伸時(shí)間

二、引物

1、設(shè)計(jì)存在問(wèn)題

建議方法：

1)查看 引物設(shè)計(jì)。使用在線(xiàn) 引物設(shè)計(jì)工具 。

2)確保引物針對(duì)目的片段具有特異性。

3)確認(rèn)引物與正確的目標(biāo)DNA鏈互補(bǔ)。

2、引物陳舊

建議方法：

1）將引物重懸和分裝，并 妥善保存。

2）將新鮮的引物分裝，或按需購(gòu)買(mǎi)新的引物。

3、用量不足

建議方法：

1）優(yōu)化引物濃度（范圍通常為0.1–1 μM）。

2）對(duì)于長(zhǎng)片段PCR和使用簡(jiǎn)并引物的PCR，最小起始濃度為 0.5 μM。

 三、其它反應(yīng)組分

1、DNA聚合酶不合適

建議方法：

1）使用熱啟動(dòng)DNA聚合酶，防止校正DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶活性導(dǎo)致引物降解。熱啟動(dòng)DNA聚合酶還能消除非特異性擴(kuò)增，從而提高目的PCR產(chǎn)物的得率。

2）或者，在冰上配制PCR反應(yīng)體系，或在反應(yīng)混合物中最后添加DNA聚合酶。

2、DNA聚合酶用量不足

建議方法：

 1）選擇具有 高靈敏度 的DNA聚合酶用于擴(kuò)增。

2）核對(duì)PCR使用的 DNA聚合酶推薦用量，并根據(jù)需要進(jìn)行優(yōu)化。

3)如果反應(yīng)混合物含有高濃度的添加劑（如，DMSO、甲酰胺）或樣品來(lái)源抑制劑，可提高DNA聚合酶用量。

3、Mg2+ 濃度不足

建議方法：

1)優(yōu)化 Mg2+ 濃度，以獲得最高的PCR得率。若存在EDTA、其它金屬螯合劑或非尋常的高濃度dNTP，則需要提高 Mg2+濃度。

2)查看DNA聚合酶對(duì)鎂鹽溶液的偏好性。例如， Pfu  DNA聚合酶與MgSO4 結(jié)合使用的效果比 MgCl2更好。

4、PCR添加劑或輔助溶劑過(guò)多

建議方法：

 1)查看PCR添加劑或輔助溶劑的 推薦濃度 。盡量使用最低濃度。

2)調(diào)整退火溫度，因?yàn)楦邼舛鹊腜CR添加劑或輔助溶劑會(huì)削弱引物與目的片段的結(jié)合。

3)增加DNA聚合酶用量，或使用具有 高合成能力的DNA聚合酶。

4)考慮使用專(zhuān)為指定DNA聚合酶設(shè)計(jì)的特殊添加劑或輔助溶劑（如， Invitrogen? Platinum? DNA聚合酶附帶的GC增強(qiáng)劑）

5、反應(yīng)混合物中的dUTP或經(jīng)修飾的核苷酸

建議方法：

1）確保選定的DNA聚合酶能夠摻入經(jīng)修飾的核苷酸。

2）優(yōu)化經(jīng)修飾的核苷酸與dNTP的比例，從而提高PCR擴(kuò)增效率。

6、不均勻的試劑

建議方法：

 1）將試劑儲(chǔ)液與制備反應(yīng)組分充分混合，消除保存和反應(yīng)配制期間可能形成的密度梯度。

四、熱循環(huán)條件

1、變性效果不理想

建議方法：

1）優(yōu)化 DNA變性 時(shí)間和溫度。變性時(shí)間短、溫度低可能無(wú)法獲得良好的雙鏈DNA模板解離效果。相反，變性時(shí)間長(zhǎng)、溫度高可能會(huì)降低酶活性。

2、退火效果不理想

建議方法：

1）盡量使用 梯度熱循環(huán)儀 ，以1–2°C增量逐步優(yōu)化退火溫度。最佳退火溫度通常比最低引物Tm低 3–5°C。

2）當(dāng)使用 PCR 添加劑或輔助溶劑 時(shí)，應(yīng)調(diào)整退火溫度。

3）使用指定DNA聚合酶在其最佳緩沖液中的 推薦退火溫度 。DNA聚合酶不同，則引物對(duì)的退火溫度也不同。

3、延伸效果不理想

建議方法：

1）選擇適合于擴(kuò)增子長(zhǎng)度的延伸時(shí)間。

2）在擴(kuò)增長(zhǎng)片段（如，>10 kb）時(shí)，降低延伸溫度（如，降至68°C）可保持酶活性。

3）使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶，在較短的延伸時(shí)間內(nèi)也能實(shí)現(xiàn) 穩(wěn)定的擴(kuò)增 。

4、PCR循環(huán)數(shù)不合適

建議方法：

1）調(diào)整循環(huán)數(shù)（通常為23-35個(gè)循環(huán)），以獲得合適的PCR產(chǎn)物得率。如果DNA起始量低于10拷貝，則將循環(huán)數(shù)增加至40。