應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-9 

三、如何設(shè)計(jì)TaqMan Array Card的布局方案 

       TaqMan 陣列卡分為庫(kù)存TAC（Inventoried TaqMan Array Card）和定制型TAC（Custom TaqMan Array Card）兩類。 

       庫(kù)存TAC針對(duì)特定應(yīng)用在卡上已包被有12-381個(gè)測(cè)定靶標(biāo)的TaqMan探針和引物組，無(wú)需用戶設(shè)計(jì)靶標(biāo)排布，可以直接使用獲得高度可重復(fù)的結(jié)果。庫(kù)存TAC有胃腸道感染病原體檢測(cè)TAC、呼吸道感染病原體檢測(cè)TAC、基因表達(dá)研究TAC、miRNA研究TAC等。 

       定制型TAC，顧名思義，實(shí)驗(yàn)者須根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求確定檢測(cè)靶標(biāo)種類、數(shù)量、單個(gè)靶標(biāo)的技術(shù)重復(fù)數(shù)和陽(yáng)性對(duì)照靶標(biāo)設(shè)置，確定TAC上靶標(biāo)陣列分布圖。TAC樣品技術(shù)重復(fù)有重復(fù)1次(singlet/no replicates)、2次(duplicates)、3次 (triplicates)和4次(quadruplicates)可選。同一靶標(biāo)技術(shù)重復(fù)孔內(nèi)的引物-探針組成分完全一致。 

       我們先來了解一下ABI庫(kù)存的標(biāo)準(zhǔn)化TAC陣列排布設(shè)置原理。 

1）Format 16、Format 32和Format 64三款TAC，每個(gè)樣品的每種靶標(biāo)為3次技術(shù)重復(fù)。

       Format 16 TAC示意圖中，左右兩列藍(lán)色數(shù)字分別8個(gè)上樣通道。16代表該款TAC可檢測(cè)靶標(biāo)的種數(shù)共16種。

       由于檢測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)控和數(shù)據(jù)分析歸一化要求，每張卡必須至少預(yù)留一個(gè)強(qiáng)制性地內(nèi)參對(duì)照靶標(biāo)（Mandatory Manufacturing Control），這樣Format 16實(shí)際可測(cè)靶標(biāo)種數(shù)為15個(gè)（Target Assays）。Format 16卡上每個(gè)靶標(biāo)3個(gè)復(fù)孔，16×3=48孔，所需反應(yīng)孔數(shù)剛好占滿一個(gè)通道48孔。整張卡可測(cè)試8個(gè)不同樣品。

2）Format 32 TAC，用于測(cè)試1個(gè)對(duì)照靶標(biāo)+31個(gè)測(cè)試靶標(biāo)，每種靶標(biāo)3次技術(shù)重復(fù)，所需反應(yīng)孔數(shù)為32×3=96個(gè)，一個(gè)樣品需占用2個(gè)檢測(cè)通道（即2×48孔），每張卡只能測(cè)試4個(gè)樣品。

3）Format 64卡，用于測(cè)試1個(gè)對(duì)照靶標(biāo)+63個(gè)測(cè)試靶標(biāo)，每種靶標(biāo)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所需反應(yīng)孔總數(shù)為64×4=192個(gè)，一個(gè)樣品占用4個(gè)檢測(cè)通道（4×48孔，即圖中Port 1-4），每張卡只能測(cè)2個(gè)樣品，樣品通量為Format 32卡的一半。

       要提高檢測(cè)效率并降低成本，最直接辦法是把技術(shù)重復(fù)數(shù)量降低。

       如Format 24，每個(gè)樣品可測(cè)試靶標(biāo)種數(shù)達(dá)到23種，每種靶標(biāo)2個(gè)技術(shù)重復(fù)，每張TAC可測(cè)試8個(gè)樣品。4342249貨號(hào)一個(gè)包裝可滿足80個(gè)動(dòng)物測(cè)試。如需篩選的靶標(biāo)種數(shù)多達(dá)數(shù)十甚至上百種，為便于后期數(shù)據(jù)分析，采用Format 48、Format 96a、Format 384 卡，一個(gè)靶點(diǎn)一個(gè)孔，或用2-3塊板來完成技術(shù)重復(fù)，無(wú)疑十分便利。

       基于以上TAC陣列排布規(guī)律和特點(diǎn)，我們來看2個(gè)兩個(gè)實(shí)例。一個(gè)Human Inflammation Array (P/N 4378707) 庫(kù)存TAC，一個(gè)定制TAC。 

        Human Inflammation Array卡上共96種靶標(biāo)（其中18S為對(duì)照），每個(gè)樣品占用2個(gè)上樣通道，相當(dāng)于Format 96a的布局（每靶標(biāo)4個(gè)技術(shù)重復(fù)）。

        TaqMan Array Card for 19 Enteropathogens即本文提到的美國(guó)弗吉尼亞大學(xué)開發(fā)的腸道病原體檢測(cè)TAC，是學(xué)術(shù)界TAC網(wǎng)紅。 

       該TAC可測(cè)試靶標(biāo)種數(shù)共24種，理論上可以實(shí)現(xiàn)每個(gè)靶點(diǎn)2個(gè)技術(shù)重復(fù)，相當(dāng)于Format 24。但實(shí)際上，它可檢測(cè)19種常見腸道病原體的23種靶標(biāo)，其中15種病原體為單靶點(diǎn)檢測(cè)，另4種病原體為雙靶點(diǎn)檢測(cè)。 

       它的對(duì)照設(shè)置有特點(diǎn)：質(zhì)控對(duì)照18S、臨床樣本陽(yáng)性對(duì)照16S均為singlet；采用了Combined positive controls對(duì)照，是針對(duì)病毒、細(xì)菌靶點(diǎn)分別設(shè)置了DNA、RNA陽(yáng)性對(duì)照。 

       技術(shù)重復(fù)設(shè)置上與標(biāo)準(zhǔn)格式有區(qū)別：病原體中Norovirus GII、C. difficile、Trichuris、Ascaris、STEC stx1和STEC stx2用的是singlet，其余病原體靶點(diǎn)統(tǒng)一為2個(gè)技術(shù)重復(fù)（并非常規(guī)qPCR中同一個(gè)樣品三個(gè)復(fù)孔法）。 

       再如嚙齒動(dòng)物TaqMan Array MicroRNA A+B Card，每張TAC包含384個(gè)TaqMan MicroRNA分析，能在5小時(shí)內(nèi)完成的641個(gè)microRNA測(cè)定。每個(gè)陣列包括三個(gè)物種內(nèi)源性對(duì)照及一個(gè)與嚙齒動(dòng)物無(wú)關(guān)的TaqMan MicroRNA靶點(diǎn)作為陰性對(duì)照。 

       上述兩個(gè)TAC案例提示我們：不同應(yīng)用類型、不同樣品，對(duì)照靶標(biāo)設(shè)置要求不完全一致。技術(shù)重復(fù)的多少、對(duì)照的設(shè)置因?qū)嶒?yàn)?zāi)康暮蜆悠樊?，是?shí)驗(yàn)者需要斟酌的，事關(guān)數(shù)據(jù)可靠性和TAC靶位陣列整體布局安排。 

（待續(xù)）