應用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-2

        采用SYBR Green I染料的實時熒光定量PCR實驗，須通過熔解曲線分析鑒別引物二聚體或非特異性擴增產(chǎn)物。然而RNA和基因組DNA具有高度遺傳多態(tài)性，非特異同源物不僅對靶片段擴增產(chǎn)生競爭抑制，當特異和非特異性擴增產(chǎn)物的Tm值接近時，解離曲線單峰形狀還難以有效區(qū)分。此外，qPCR實驗經(jīng)常出現(xiàn)擴增曲線的基線期過長、指數(shù)增長期出現(xiàn)晚且曲線低平、Ct值偏大現(xiàn)象，一般視為擴增效率過低的表現(xiàn)。
qPCR實驗擴增效率和特異性問題，在排除引物設(shè)計不當、模板片段過長或數(shù)量過少、樣品中存在酶活性抑制、同源物競爭抑制等反應組份的因素后，常嘗試用恢復變性-退火-延伸三步法擴增程序、調(diào)整優(yōu)化退火溫度的辦法來解決。
        對于普通PCR實驗優(yōu)化引物退火溫度實屬老生常談。有人認為，在梯度PCR儀上摸出最佳退火條件后，將參數(shù)直接嵌入qPCR儀運行程序就行了，無需作條件再優(yōu)化的無用功。這種觀點不全對，因其成立是有嚴格條件限制的，對多數(shù)實驗環(huán)境并不適用。我們來就實時熒光定量PCR實驗反應條件優(yōu)化的議題展開討論，以圖澄清一些似是而非的觀點，并從中領(lǐng)略對qPCR實驗和選型的有益啟示。

一、傳統(tǒng)PCR熱循環(huán)模塊梯度溫控原理與局限性
        梯度PCR通常指在引物退火溫度不明確、擴增效果不理想的情況下，借助于PCR儀內(nèi)置算法在一定溫度范圍內(nèi)，從高到低依次生成一系列差異化溫度，作為模塊中不同位置各組樣品退火溫度，進行同步擴增，最后根據(jù)擴增特異性、擴增產(chǎn)物含量優(yōu)選出引物最適退火溫度，用做正式擴增參數(shù)。
        自eppendorf首開PCR儀溫度梯度控制技術(shù)先河，引物退火溫度優(yōu)化與模塊梯度溫功能就被緊密關(guān)聯(lián)起來。而均一金屬模塊實現(xiàn)梯次差別化溫控的原理，業(yè)內(nèi)長期諱莫如深。
        2017年，一份Applied Biosystems發(fā)布的測評文件揭開傳統(tǒng)溫度梯度控制的技術(shù)原理。
        文件有3個要點：
1.1 PCR梯度溫度模塊結(jié)構(gòu)決定了其固有缺陷
        PCR模塊溫度梯度控制單元的構(gòu)造，通常是樣品模塊底部兩端分設(shè)1個單獨加熱/冷卻元件。均勻一體的金屬模塊只能有效控制兩端設(shè)定的高、低兩個起止點的溫度，而模塊中間大部區(qū)域的溫度，完全受熱力學傳導規(guī)律支配，是模塊兩端高低溫區(qū)相互作用自然形成的，無法實施有效控制。

1.2梯度溫度值是理論預測值而非真實退火溫度
        除Bioer GeneMax PCR儀、Agilent 等少數(shù)機型，大部分常見PCR金屬模塊上溫度間梯度落差不均勻，溫度值落差曲線呈中間高兩頭低的峰型。

        資料顯示，伯樂T100、S1000、C1000-touch是以行的形式生成8個梯度，而eppendorf Mastercycler nexus則按列的方式從左到右依次形成12個梯度溫度。
        將技術(shù)資料示例圖中的溫度值轉(zhuǎn)換成梯度序號-梯度溫度散點圖后，結(jié)果顯示，梯度溫度分布曲線確實為兩端平緩、中間近似線性走勢的形狀，與qPCR實驗中低效擴增曲線神似。
 
        在梯度PCR反應參數(shù)設(shè)定環(huán)節(jié)，將梯度范圍的高低兩端溫度值輸入后，系統(tǒng)立即顯示出不同樣品區(qū)域溫度值。說明，這一系列數(shù)值只是計算理論模型的預測值。

 
1.3 由算法模型生成的區(qū)域梯度溫度與實測值均存在不同程度偏差。
        T100 PCR儀偏差+0.6℃ @50℃，Mastercycler Nexus PCR儀偏離–0.4℃ @61.8℃。
        當今PCR儀熱循環(huán)模塊35℃～99.9℃范圍控溫精度已達到±0.2-0.25℃，而測評中樣品實際退火溫度與梯度模型理論計算值的偏離程度達到0.4℃-0.6℃，已遠超系統(tǒng)正常溫控誤差范圍。表明，系統(tǒng)梯度算法模型生成梯度溫度是不受控制的，并非樣品所處的真實溫度。
        以圖中第6列59.4℃與第7列60.6℃為例，綜合考慮算法誤差0.4℃、模塊控溫誤差0.2℃后，59.4℃與60.6℃兩列樣品實際溫度很可能是重疊的。
        因此，儀器梯度溫度示值，只能視作特定實驗條件下接近于引物實際退火溫度的理論值之一，而非確定值。不同品牌儀器梯度模型算法的不同，計算誤差有別。故換臺機器進行同一個樣品梯度實驗，最佳退火溫度的示值很可能會發(fā)生偏移。
        將特定條件下梯度示值認定該引物最適退火溫度推而廣之，跨平臺照搬重復實驗，在理論上確有刻舟求劍之虞。
        實際上，除了平臺間引物退火溫度算法誤差造成溫度界定模糊，正如《PCR升降溫速度在實時熒光定量PCR實驗中的作用與意義-下》所論，不同PCR模塊變溫速度特性不一，同樣對對跨平臺移植PCR運行程序的實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。
        關(guān)于PCR變溫速率控制技術(shù)優(yōu)劣問題，業(yè)內(nèi)意見分為兩派，一派是ABI、伯樂等代表的“動態(tài)變溫速率”派，另一派是eppendorf代表的恒速變溫派。 
        1）恒速變溫派認為，PCR熱循環(huán)模塊在變形-退火-延伸循環(huán)的變溫曲線斜率應該保持恒定（即SteadySlope），這樣確保采用SteadySlope技術(shù)的平臺間可以相互復制運行協(xié)議，機器運行狀態(tài)保持一致，無需重新優(yōu)化退火條件便可確保擴增的完美重復。相反，若其中一臺機器缺乏SteadySlope控制，即便運行相同protocol，也因變溫速率特性不同，造成運行狀態(tài)的差異和實驗結(jié)果不一致。

         2）動態(tài)變溫派則認為，動態(tài)變溫曲線控制技術(shù)優(yōu)點顯而易見：確保運行相同協(xié)議時，模塊溫度轉(zhuǎn)換進程的相同時間內(nèi)同步抵達不同梯度溫度而非梯次到達，確保各梯度溫度的維持時間保持一致。而恒速變溫由于所有梯度進程的變溫速率相同，造成溫度跳轉(zhuǎn)“里程”差，不同樣品在退火溫度環(huán)節(jié)保持時間出現(xiàn)差異：梯度值高的樣品退火溫度保持時間最長，梯度值低的樣品保持時間最短。梯度溫度保持時間的差異，必然影響各組的擴增效果，從而影響優(yōu)選溫度的可靠性。

        其實，無論是SteadySlope技術(shù)，還是動態(tài)變溫技術(shù)，想讓PCR運行協(xié)議跨平臺移植共享都是有前提的，即不同平臺循環(huán)模塊升降溫特征的基本一致。如QuantStudio 3、QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀均配置了通用96×0.1mL快速反應模塊， 二者間多數(shù)qPCR協(xié)議就可以相互傳遞直接運行。但若該協(xié)議植入StepOnePlus或CFX Duet、CFX Opus 96/CFX96-Touch中運行，要取得一致實驗結(jié)果，則絕非易事。
        為適應PCR運行程序跨平臺應用需求，廠商開發(fā)了熱力學模擬功能模式 (Simulation Mode)，即A機通過模擬B機的升溫速率以便獲得一致擴增結(jié)果。如VertiPro PCR儀模仿Veriti、9700、C1000-touch、T100等多個品牌熱循環(huán)儀的升溫核心特征，導入被模擬對象上運行程序直接啟動實驗。

         模擬功能具有向下兼容的特點，只能模擬變溫速率相對低的機型，范圍限于普通PCR儀，qPCR系統(tǒng)尚不適用。

（待續(xù)）