關(guān)于核酸濃度純度測定具體指標的問題，《MIQE指南對qPCR實驗中核酸紫外測定的要求-下》已有專門討論，即核酸純度評估應采用A260/A280、A260/A230雙比值法，核酸濃度測定用A260指標即可，核酸樣品的濃度、純度測定不可偏廢。

       主流微量紫外可見光度計的核酸測定應用程序，所建立的標準化的測試和報告體系，通常都具備以下功能特征：

        1）若是用非標準比色皿光程進行的吸光度檢測，系統(tǒng)會按先長（光程）后短（光程）的次序自動進行多光程的吸光度測定，自動選擇最佳測試光程（介于1.0mm和0.03mm之間）下讀數(shù)作為計算依據(jù)。軟件自動將測定初始值歸一化為10mm光程的當量值，用于計算核酸濃度、A260/A230和A260/A280比率；

        2）雙鏈DNA（dsDNA）、單鏈DNA（ssDNA）或RNA樣品測定完成，系統(tǒng)默認報告核酸濃度、兩個吸光度比值（A260/A280和A260/A230）和吸光度-濃度換算系數(shù)；

        3）核酸濃度以選中的單位（即ng/μL、μg/μL或μg/mL）報告。計算公式為：

                                         c=A·f

其中：

A：歸一化為10mm光程的吸光度，以吸光度單位(A)表示；

F：吸光度-核酸濃度計算系數(shù)的單位為ng-cm/μL。雙鏈DNA系數(shù)為50 ng-cm/μL；單鏈DNA系數(shù)為33 ng-cm/μL；RNA系數(shù)為40 ng-cm/μL；

C：濃度單位為ng/μL。

       以NanoDrop One、NanoDrop OneC微量紫外可見光度計的dsDNA測定為例，測定結(jié)果報告自動給出濃度（單位ng/μL）、A260/A280計算值、A260/A230計算值、A260和A280測定值。                                              

       NanoDrop One dsDNA樣品測試結(jié)果的報告界面還標注了結(jié)果計算中采用了340nm 基線矯正（Baseline Correction）算法。正常情況下，純化的核酸樣品吸收波長掃描曲線，存在一峰（260nm吸收峰）、一谷（230nm吸收低谷）和一平（340nm波長開始光吸收降低到0，與檢測器背景信號基線近乎平行）。但因不同測試溶液條件和檢測器自身背景信號，樣品吸光度值可能存在偏差。所謂基線矯正，是指系統(tǒng)從樣品所有波長的吸光度值（如核酸的A260、A280和A230原始測定值）減去指定基線矯正波長的吸光度值（如核酸常用的A340），對測試值進行修正。

       Implen NanoPhotometer NP80、N60、N50微量紫外光度計的DNA測定結(jié)果報告中，系統(tǒng)給出了測定物質(zhì)和測定方法、ng/μL濃度、消光系數(shù)、A260/A280值、A260/A230值、A230 、A260和A280測定值，并對存在異常的測定值予以警示標志。

       資料顯示，國產(chǎn)的Nano 100、Nano 300微量紫外可見光度計的核酸樣品測試結(jié)果報告中，所列事項與前述兩款進口機型此基本一致。

       NanoVolume類微量紫外可見光度計，無論是NanoDrop One、NanoDrop Eight、NanoPhotometerNP80/N60/N50、Nano300等全波長掃描功能的標準機型，還是NanoDrop Lite Plus和Nano 400這類檢測光源為230nm、260nm、280nm固定波長的精簡版型號，系統(tǒng)預置測定協(xié)議生成的測試報告事項，完全符合MIQE指南所規(guī)定的核酸質(zhì)量評估控制要求。這樣，省去繁瑣的參數(shù)設定和測定數(shù)據(jù)手工計算，極大方便了核酸樣品質(zhì)量的測評工作。

       如無現(xiàn)成的NanoVolume紫外測定工具，如何利用普通紫外可見分光光度計進行核酸純度濃度測定？

       最經(jīng)濟易行的解決方案是eppendorf的UVette比色皿。

       UVette比色皿同時具有兩種光程長度 ，將UVette 旋轉(zhuǎn) 90°可在10 mm 和2 mm兩種光程間切換。對于PCR、反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR實驗，樣品經(jīng)適度稀釋后，參考50μL的加樣量和采用2mm光程進行測定，或許有助于解決微量樣品測定中的基本難題。

       UVette比色皿具有較好的兼容性。在標準測試光束高度8.5mm的分光光度計中，可以直接使用UVette比色皿，其操作方法即與常規(guī)比色皿測試操作一致。針對測試光束距離檢測池底部的高度為10mm、15mm的光度計，添加eppendorf提供相應比色皿適配器，將適配器-比色皿組合疊加固定后，安裝到標準光程檢測池內(nèi)測試即可正常使用。

        通常，綜合應用型紫外光度計儀器檢測參數(shù)設置比較繁瑣。它要求操作者對測試方法體系了然于胸，同時還要熟悉儀器本身設置方法和設定選項的涵義。

       以日立UH5300的核酸測定應用為例。系統(tǒng)提供了核酸樣品測量功能模塊，可用于核酸樣品230 nm，260 nm，280 nm和320 nm四個測試波長吸光度測定，并根據(jù)測量吸光度和吸光度比（A260 / A280，A260 / A230）計算核酸的純度，濃度等。

       開機后需完成如下步驟設置：

測量條件設置(Measurement Conditions)

樣品條件設置(Setting Sample Conditions)

測量條件設置(Setting Measurement Conditions)

核酸濃度條件設置(Setting Nucleic Acid Concentration Conditions)

檢測池6個比色皿樣品的設置（Setting 6 Cells)

對照項設置 (Setting Control Items)

打印條件設置 (Setting Printing Conditions)

保存條件設置 (Setting Condition Saving)

測量樣品溶液設置(Measuring Sample Solution)

保存和打印數(shù)據(jù)設置(Saving and Printing Data)

       慶幸的是，測定參數(shù)中的核酸濃度計算因子、核酸濃度單位、核酸純度、核酸純度比值標準等關(guān)鍵設置，程序都預置有可選項，無須手工輸入。從工作界面上看，與NanoDrop One、NanoPhotometer N60 和Nano 300等生物學專用微量紫外可見光度計比，UH5300的應用程序中并未將核酸具體類型細分，Expected Ration、Nucleic Acid Conc factor與核酸類型間的對應關(guān)系，實驗者必須十分熟悉且準確無誤才行。

參考文獻
NanoDrop One Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Rev. E)
NanoPhotometer N120/NP80/N60/N50/C40 User Manual (Version 4.3.4)
Nano-300 微量分光光度計操作手冊(Version 2.0)
Eppendorf UVette Universal Adapter Use Instructions
Model Uh5300 Spectrophotometer Instruction Manual