（前續(xù)：Optima Max-xp超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的選擇對(duì)外泌體分離效果影響的分析）

       用差速離離心方法從不同功能狀態(tài)活細(xì)胞群來(lái)源的細(xì)胞外囊泡群中分離外泌體，是常用的的外泌體分離方法。差速離心的實(shí)現(xiàn)依賴于樣品顆粒的沉降屬性。在設(shè)定的RCF環(huán)境下，離心機(jī)轉(zhuǎn)頭內(nèi)部RCF分布不均衡，多數(shù)情況下，離心沉淀組分中，均不止直徑40-150nm的外泌體，往往還夾雜直徑100-300nm的其它EVs組分。離心沉淀中組分構(gòu)成不同，是導(dǎo)致不同研究數(shù)據(jù)差異的重要原因。不同離心時(shí)間，樣品管內(nèi)不同大小、組成、密度的顆粒發(fā)生共沉淀難以有效避免。研究表明，沉淀物中外泌體和脫落囊泡比例、非囊泡類生物大分子的構(gòu)成比例有時(shí)間依賴性。
目前，對(duì)外泌體的發(fā)生起源、功能作用尚處于探索階段。超速離心時(shí)間的設(shè)定，在實(shí)踐中尚無(wú)嚴(yán)格統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。而超速離心時(shí)間選擇，不僅關(guān)乎實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，還對(duì)整體實(shí)驗(yàn)工作進(jìn)程有直接影響。我們有必要來(lái)探討外泌體分離流程中的超速離心時(shí)間如何設(shè)置這一復(fù)雜問(wèn)題。

1、外泌體分離中影響時(shí)間設(shè)定的轉(zhuǎn)頭因素

       樣品離心沉淀所需時(shí)間（沉降時(shí)間）主要由樣品組分在特定條件下的沉降系數(shù)、工作轉(zhuǎn)速和特定轉(zhuǎn)頭的Rmax與Rmin比值三個(gè)因素決定。用公式可表述為： 

T_s = (1/S) ? (1/ω² ) ? ln(R_max/R_min)  ······················································· (9)

       規(guī)定K因子值的定義后，公式(9)可轉(zhuǎn)變?yōu)椋?/span>

T_s = k/S   ······················································································· ·················· (10)

       樣品組分的沉降屬性與自身密度、溶液溫度和粘度有關(guān)。高濃度蔗糖溶液、添加血清的培養(yǎng)基環(huán)境下，細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞器沉降速度會(huì)降低。

       公式(10)表明：在樣品條件相同情況下，離心時(shí)間長(zhǎng)短與所用轉(zhuǎn)頭的k因子值大小有關(guān)。K因子小，沉降時(shí)間短；K因子值大，沉降時(shí)間長(zhǎng)。
有研究證實(shí)：水平轉(zhuǎn)頭之間，根據(jù)轉(zhuǎn)頭各自有效k因子值的對(duì)比關(guān)系來(lái)優(yōu)化調(diào)整有效離心時(shí)間，可取得較一致的分離結(jié)果。但此方法不適用于角轉(zhuǎn)頭之間離心時(shí)間的調(diào)整。
       外泌體超速分離中，為確保溶液中樣品回收率同時(shí)兼顧離心工作效率，運(yùn)用轉(zhuǎn)頭K因子值與沉降時(shí)間的關(guān)系原理，調(diào)整離有效離心時(shí)間是意義的：對(duì)R_min較小的轉(zhuǎn)頭宜適度延長(zhǎng)離心時(shí)間；若采用相同離心時(shí)間設(shè)置，則可嘗試將R_min小的轉(zhuǎn)頭宜適度提高RCF值，如從100000×g調(diào)整為110000×g。
       以單管容量均為39mL的MLA-50與Type 70 Ti兩個(gè)轉(zhuǎn)頭為例：Type 70 Ti的R_min和RCF_min大、K因子值小，故分離效能高于MLA-50。如參考方案是Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭100000×g下離心70分鐘設(shè)置，則多半采用快速升降速模式設(shè)置。要用MLA-50轉(zhuǎn)頭來(lái)替代則離心時(shí)間應(yīng)適度延長(zhǎng)。反之，若參考方案為MLA-50轉(zhuǎn)頭，而采用Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭進(jìn)行，則延長(zhǎng)離心時(shí)間不必延長(zhǎng)。
       離心時(shí)間設(shè)置，不能僅考慮樣品組分有效沉降時(shí)間，還須結(jié)合實(shí)際所用轉(zhuǎn)頭升降速過(guò)程占用時(shí)間的差別。

        轉(zhuǎn)頭運(yùn)行時(shí)間分為啟動(dòng)加速、穩(wěn)定運(yùn)行和剎車減速三個(gè)階段。而樣品有效沉降時(shí)間只相當(dāng)于剔除加速、減速兩個(gè)階段后轉(zhuǎn)頭持續(xù)穩(wěn)定在設(shè)定轉(zhuǎn)速或RCF狀態(tài)運(yùn)行的時(shí)間。超速離心的設(shè)定時(shí)間，除了樣品所需的有效沉降時(shí)間，還需將轉(zhuǎn)頭加減速階段耗費(fèi)時(shí)長(zhǎng)納入考慮。即：超速離心設(shè)定時(shí)間要大于樣品沉降所需時(shí)長(zhǎng)。
        不同型號(hào)超速轉(zhuǎn)頭的自重不同、空載與滿載情況下，轉(zhuǎn)頭加減速過(guò)程所需時(shí)間不同。轉(zhuǎn)頭負(fù)重大，加減速耗時(shí)長(zhǎng)。此外，設(shè)定的工作轉(zhuǎn)速高，加減速耗時(shí)長(zhǎng)，則設(shè)定離心時(shí)間要相應(yīng)延長(zhǎng)（見(jiàn)表7）。

表7  Beckman Optima臺(tái)式、立式超離轉(zhuǎn)頭滿載情況下加速、減速時(shí)長(zhǎng)列表

（工作轉(zhuǎn)速值參考離心力-轉(zhuǎn)速在線換算工具h(yuǎn)ttps://novopro.cn/tools/g-force-rpm-convertion.html計(jì)算結(jié)果得出）。

       數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)頭滿載并以最快速度加減速時(shí)，多數(shù)轉(zhuǎn)頭加速慢而減速快。
       但最快升降速模式并不適用于所有轉(zhuǎn)頭類型、離心管、樣品載量和應(yīng)用方法。無(wú)論角轉(zhuǎn)頭或水平轉(zhuǎn)頭，使用無(wú)蓋開(kāi)口管且樣品滿載狀態(tài)下，啟動(dòng)和剎車宜盡量平緩以避免啟動(dòng)剎車過(guò)猛引發(fā)樣品外溢損失。而用垂直轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭和角轉(zhuǎn)頭密度梯度離心，平緩減速或轉(zhuǎn)頭自由減速，可避免已完成分離梯度液層混合風(fēng)險(xiǎn)。

       Beckman超離心內(nèi)置有超平穩(wěn)控制功能（Ultra Harmonic Technology, UHT），是通過(guò)內(nèi)置UHT程序控制轉(zhuǎn)頭升降速的速度變化曲線。以Optima MAX-XP為例，加減速過(guò)程設(shè)置有10檔升、11檔降的UHT控制程序可選（見(jiàn)表8）。

表8 Acceleration and Deceleration Rates

       加速ACCEL控制程序分別用數(shù)字1-9和無(wú)數(shù)字表示共10檔，而減速DECEL控制程序分為0-9和無(wú)數(shù)字共11檔。超速離心的加減速過(guò)程控制各分為兩個(gè)階段：0-5000rpn階段和5000rpm – 設(shè)定轉(zhuǎn)速階段。無(wú)論升速、降速，5000rpm-工作轉(zhuǎn)速階段，系統(tǒng)均以系統(tǒng)默認(rèn)的最快速度進(jìn)行不受人工干預(yù)。而0-5000rpn低速階段，則由ACCEL\DECEL程序調(diào)控。數(shù)字代碼從1至9，轉(zhuǎn)頭升降速的時(shí)間以30秒-1分幅度遞增。1檔較短，9檔最長(zhǎng)。0檔為自由落體式減速耗時(shí)超過(guò)10分鐘。不輸入檔位代碼數(shù)字，則轉(zhuǎn)頭從0-設(shè)定轉(zhuǎn)速的全過(guò)程均以最快變速完成升降速過(guò)程。

       數(shù)據(jù)表明，僅0-5000rpm這一過(guò)程一升一降兩個(gè)階段各取中位數(shù)累計(jì)時(shí)間就長(zhǎng)達(dá)5分半鐘。再將5000rpm至設(shè)定工作轉(zhuǎn)速（如設(shè)定為30000rpm）最快變速階段時(shí)間，則升降速過(guò)程耗時(shí)至少在7分鐘以上。這一點(diǎn)從表7提供的轉(zhuǎn)頭升降速時(shí)間看，實(shí)際超過(guò)10分鐘。

       因此，為確保樣品有效離心時(shí)間不低于60分鐘，“基礎(chǔ)流程1”建議在滿足100000×g RCF的條件下超離時(shí)間設(shè)置為60+N分鐘，N值大小對(duì)應(yīng)的正是轉(zhuǎn)頭的加減速時(shí)長(zhǎng)。

2、外泌體超速分離流程中離心時(shí)間設(shè)置存在的爭(zhēng)議
        在已報(bào)道的63個(gè)實(shí)例中，27例的時(shí)間設(shè)置為70-90分鐘，多達(dá)16例的設(shè)置為120分鐘，3例為3小時(shí)，還有1例是4小時(shí)的設(shè)置。其中，轉(zhuǎn)頭型號(hào)可查實(shí)的37例中，所用轉(zhuǎn)頭與時(shí)間設(shè)置情況見(jiàn)表9。表中編號(hào)213、229、106、273的不同實(shí)驗(yàn)，工作溫度、緩沖液、轉(zhuǎn)頭（TLA-100.3）、主機(jī)和RCF設(shè)置都相同，而離心時(shí)間竟出現(xiàn)了120 min、240 min、60 min和70 min四種設(shè)置。

表9 部分文獻(xiàn)中外泌體超速離心時(shí)間設(shè)置與轉(zhuǎn)頭工作參數(shù)表

       表中相同RCF設(shè)置下，離心時(shí)間60--120min不等的現(xiàn)象極為常見(jiàn)。可見(jiàn)，關(guān)于離心時(shí)間設(shè)置問(wèn)題，學(xué)界并無(wú)一致意見(jiàn)。

       不同實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中，造成離心時(shí)間差異懸殊，是由實(shí)驗(yàn)樣品本身和外部離心條件的內(nèi)外因綜合作用的結(jié)果。

       首先是外因方面，不同型號(hào)轉(zhuǎn)頭、相同RCF設(shè)置下分離效能存在區(qū)別是不爭(zhēng)的事實(shí)(見(jiàn)表10)。單管樣品容量均為39mL的5款轉(zhuǎn)頭TYPE 70 Ti、TYPE 50.2 Ti、VTi 50.1、SW 32 Ti和SW 28之間，在相同118000×g的RCF設(shè)定下，離心效能最高是VTi 50.1，其次是TYPE 70 Ti、TYPE 50.2，水平轉(zhuǎn)頭SW 28墊底。若TYPE 70 Ti有效離心時(shí)間為60分鐘，從k因子值大小這一常識(shí)即可推定SW 32 Ti和SW 28連個(gè)水平轉(zhuǎn)頭有效離心時(shí)間遠(yuǎn)超60分鐘。

表10 不同類型轉(zhuǎn)頭在118000×g RCF設(shè)定下轉(zhuǎn)速-K因子值-沉降時(shí)間表

       具體實(shí)驗(yàn)中，如SW 32 Ti轉(zhuǎn)頭4小時(shí)離心時(shí)間收獲的樣品組分與TYPE 70 Ti轉(zhuǎn)頭70分鐘、VTi 50.1離心50分鐘外泌體產(chǎn)量達(dá)到了相同分析效果是極為正常的。另外，衡量外泌體產(chǎn)量的所用方法同樣十分關(guān)鍵。提取離心沉淀中總RNA含量用Bioanalyzer 2100檢測(cè)而非實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其測(cè)試數(shù)據(jù)特異性存疑。Western Blot無(wú)法區(qū)分體積較大的細(xì)胞外囊泡、凋亡體、外泌體以及死亡細(xì)胞解體所釋放的TSG101蛋白。

       “基礎(chǔ)流程1”提到了離心3個(gè)小時(shí)無(wú)損外泌體囊泡結(jié)構(gòu)。所謂過(guò)猶不及，離心時(shí)間并非越長(zhǎng)越好。延長(zhǎng)離心時(shí)間，將使富含蛋白質(zhì)的囊泡顆粒及可溶性蛋白質(zhì)等非囊泡類組分的聚集沉淀，加劇外泌體中蛋白污染程度。對(duì)此，目前學(xué)界的看法是有共識(shí)的。因此，外泌體含量評(píng)價(jià)方法存在缺陷情況下界定的外泌體產(chǎn)量，不足為據(jù)。

      其次，外泌體的分泌是一動(dòng)態(tài)過(guò)程，它與細(xì)胞自身功能狀態(tài)、培養(yǎng)基中自帶外泌體排空以及培養(yǎng)條件密切相關(guān)。不同實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞自身活性、功能狀態(tài)以及培養(yǎng)處理?xiàng)l件的差別，造成細(xì)胞外泌體的分泌效率存在區(qū)別。若無(wú)細(xì)胞生理功能狀態(tài)特定指標(biāo)的支持，僅憑培養(yǎng)基中細(xì)胞數(shù)量基數(shù)評(píng)估外泌體提取產(chǎn)量，結(jié)果值得商榷。

       不應(yīng)輕易得出外泌體分離時(shí)間以4小時(shí)之內(nèi)為宜，70分鐘離心時(shí)間無(wú)法分離出外泌體無(wú)效的結(jié)論。

       特定 RCF設(shè)置下外泌體離心時(shí)間、囊泡直徑大小截止范圍（cut-off）的技術(shù)工具的出現(xiàn)以及大量文獻(xiàn)實(shí)例證據(jù)，都不足以支持70分鐘離心時(shí)間無(wú)效的觀點(diǎn)。

3、外泌體超速分離離心時(shí)間的設(shè)置原則與方法
       關(guān)于外泌體超速離心分離流程細(xì)節(jié)信息的匯報(bào)，MISEV2018指南除了要求披露實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)頭型號(hào)、樣品管、RCF設(shè)置、k因子有效值、離心時(shí)間和離心溫度等要素，還需提供轉(zhuǎn)頭加減速設(shè)置參數(shù)?？梢?jiàn)，離心時(shí)間設(shè)置離不開(kāi)所用的樣品體積、轉(zhuǎn)頭工作性能條件。
       轉(zhuǎn)頭的選擇需要遵循兩個(gè)原則：
1）研究對(duì)象相似
       不同來(lái)源樣本材料、不同生理病理狀態(tài)下的細(xì)胞分泌的外泌體種類、數(shù)量存在差異。因此，從初始樣品材料相同或相近的外泌體研究參考文獻(xiàn)中，篩選出對(duì)超速離心流程的離心時(shí)間、RCF設(shè)置、溫度和轉(zhuǎn)頭型號(hào)、離心管貨號(hào)及轉(zhuǎn)頭加減速信息披露完整的實(shí)例，摘錄其實(shí)驗(yàn)參數(shù)條件。其中，離心時(shí)間、RCF設(shè)置和轉(zhuǎn)頭型號(hào)信息必不可少。
2）轉(zhuǎn)頭性能相近
       當(dāng)轉(zhuǎn)頭型號(hào)與參考方案中不一致時(shí)，按轉(zhuǎn)頭型號(hào)——類型——樣品容量的優(yōu)先順序，選擇與參考轉(zhuǎn)頭效能匹配的超離轉(zhuǎn)頭。
       外泌體超速分離實(shí)驗(yàn)中，不可脫離自身?xiàng)l件，簡(jiǎn)單照搬參考文獻(xiàn)的時(shí)間參數(shù)設(shè)置。這不僅浪費(fèi)資源和時(shí)間，還可能危及外泌體分離結(jié)果。工作參數(shù)優(yōu)化調(diào)整方法，可參考《Optima MAX-XP超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的選擇對(duì)外泌體分離效果影響的分析》中“根據(jù)轉(zhuǎn)頭工作效能確定外泌體超速離心分離解決方案”一節(jié)內(nèi)容。
       工作參數(shù)的調(diào)整有兩個(gè)途徑。一是優(yōu)化離心時(shí)間，二是優(yōu)化RCF設(shè)置。
       當(dāng)RCF值明確后，為確保樣品回收率和離心效率，對(duì)R_min小的轉(zhuǎn)頭宜適度延長(zhǎng)離心時(shí)間。以O(shè)ptima MAX-XP臺(tái)式超速離心機(jī)用的MLA-50與Optima XE -90立式超離用Type 70 Ti為例。雖然均為單管容量39mL的角轉(zhuǎn)頭，但相同RCF設(shè)置下，Type 70 Ti具有較大R_min、RCF_min和較小K因子值，其分離效能高于MLA-50。如參考方案為Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭4℃下100000xg離心70分鐘設(shè)置，用MLA-50轉(zhuǎn)頭替代時(shí)，離心時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)是必要的。反之，若參考對(duì)象是MLA-50，而實(shí)驗(yàn)者用Type 70 Ti，則延長(zhǎng)離心時(shí)間意義不大。
       外泌體分離的品質(zhì)與轉(zhuǎn)頭內(nèi)部RCF分布有關(guān)。為確保離心管內(nèi)RCF條件接近，考慮到MLA-50和Type 70 Ti之間R_min的巨大差異，單純用相同RCF設(shè)置不夠，還應(yīng)考慮將MLA-50轉(zhuǎn)頭RCF_min調(diào)整至與Type 79 Ti相近的水平。計(jì)算表明，Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭若設(shè)定為100000xg RCF，則將MLA-50轉(zhuǎn)頭的RCF設(shè)置提升至123600×g后，兩個(gè)轉(zhuǎn)頭中離心管的中上部位RCF的分布條件比較接近，有助于獲得與Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭接近的分離效果。

(后續(xù)：臺(tái)式超速離心機(jī)Optima Max-XP在外泌體分離操作細(xì)節(jié)匯報(bào)中應(yīng)注意的問(wèn)題)