（前續(xù)：Optima MAX-XP臺式超速離心機(jī)在外泌體分離中轉(zhuǎn)頭的運(yùn)用）

        術(shù)語“外泌體”本意是指細(xì)胞外囊泡EVs中直徑范圍40-150nm的小直徑顆粒亞群(sEVs)。其中既有體積大小接近的微囊泡、外泌體，也有源自不同亞細(xì)胞區(qū)室的外泌體。囊泡中內(nèi)核酸含量及組成并不相同。相同RCF及時(shí)間設(shè)置下，不同轉(zhuǎn)頭類型、型號，所分離的沉淀中、150?nm, 120?nm, 100?nm和70?nm直徑囊泡的組成比例存在差異。此外，不同轉(zhuǎn)頭對顆粒直徑接近但浮力密度（浮力密度有關(guān)概念可參考《試析近垂直轉(zhuǎn)子在超速離心中的應(yīng)用-下》中“2.2 NVT轉(zhuǎn)頭應(yīng)用的獨(dú)特效率優(yōu)勢”部分內(nèi)容）分布不同囊泡群的沉淀效能不同。研究表明，用目前廣泛采用的100000-110000xg下4℃超速離心方法獲得的腦組織來源的EVs沉淀物，經(jīng)進(jìn)一步蔗糖或碘沙醇密度梯度離心后，可分離出多達(dá)8個(gè)浮力密度組分。
       不同轉(zhuǎn)頭及工作設(shè)置下進(jìn)行的超速分離的外泌體的產(chǎn)量、組成和污染物含量存在不確定性。對此，早已引起學(xué)界的關(guān)注。
        要理解超速轉(zhuǎn)頭是如何影響外泌體分離效果，需要從轉(zhuǎn)頭的工作原理這一源頭說起。

1、不同轉(zhuǎn)頭類型內(nèi)部RCF分布和樣品組分沉降遷移路線的區(qū)別
1.1 轉(zhuǎn)頭內(nèi)部RCF強(qiáng)弱分布不同對樣品組分分離效果的影響

       做圓周運(yùn)動(dòng)物體所受的離心力F計(jì)算公式為：

       F = m ·ω2/r  ······················································ (1)

       公式中，ω為圓周運(yùn)動(dòng)的角速度，r為圓周遠(yuǎn)動(dòng)半徑。                                              

       離心機(jī)行業(yè)中，轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速N規(guī)定用每分鐘轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)動(dòng)多少圈 (ration per minute，RPM) 來表示。N轉(zhuǎn)速與轉(zhuǎn)頭角速度ω間的換算關(guān)系為

：ω = 2π·N/60  ···················································· (2)

       由此得到轉(zhuǎn)頭離心力與離心機(jī)轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速N的計(jì)算公式：

F = m · π2 · N2 · r/900  ···············································(3)

       業(yè)內(nèi)規(guī)定用物體在離心場中的離心加速度與在重力場中重力加速度（g=9.8米/秒）的倍比值，即相對離心加速度與相對離心力場（relative centrifugation filed, RCF），來反映物體的離心作用強(qiáng)度，即：

RCF = F/m · g   ···············································(4)

       將長度單位米統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為厘米，可得到以下離心機(jī)轉(zhuǎn)頭RCF計(jì)算公式：

RCF = 1.118 · 10-5 · N2 ·ｒ(×g)  ···············································(5)

       公式(5)表明：
        1）RCF強(qiáng)度值與離心半徑相關(guān)
        不同轉(zhuǎn)頭Rav離心半徑不同，轉(zhuǎn)速N相同，但轉(zhuǎn)頭RCF并不相同。
        2）轉(zhuǎn)速N變化對RCF影響明顯
        轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速增加使RCF呈現(xiàn)指數(shù)級增長。轉(zhuǎn)速越高，轉(zhuǎn)頭內(nèi)部不同位置的RCF差距更大。

       3）同一轉(zhuǎn)頭內(nèi)部不同位置離轉(zhuǎn)軸距離不同，RCF強(qiáng)弱不同。
       無論角轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭或水平轉(zhuǎn)頭，離心機(jī)轉(zhuǎn)頭內(nèi)部不同位置的RCF強(qiáng)度分布存在差別。通常，離心管口內(nèi)側(cè)的離心半徑最小、RCF最??；管底外側(cè)的離心半徑最大故RCF最大。整體上，離心管上半部離轉(zhuǎn)軸較近，該區(qū)域RCF整體小于離心管的下半部。

       同一質(zhì)點(diǎn)沿著離心半徑方向移動(dòng)，所受離心力大小由所在位置的離心半徑?jīng)Q定。半徑大，所受離心力大，克服溶液內(nèi)部各種阻力離心方向水平遷移的驅(qū)動(dòng)力大，沉降速度快。若以離心管中心點(diǎn)引出的水平線為界，從管口到分界線的前半段，細(xì)胞碎片、細(xì)胞器和細(xì)胞外囊泡等樣品顆粒所處環(huán)境RCF強(qiáng)度整體上低于RCF設(shè)定值，故此階段沉降速度較低、對不同浮力密度小、直徑小顆粒的沉降能力效率低。越過分界線后，所處環(huán)境RCF整體高于RCF設(shè)定值，對樣品組分中密度較小、直徑較小的顆粒沉降效能增強(qiáng)，各種顆粒遷移速度增加，并在觸壁后沿著管壁滑降至管底Rmax位置形成沉淀混合物。
       因此，不同轉(zhuǎn)頭雖然RCF設(shè)定相同，但內(nèi)部RCF強(qiáng)度分布不均衡、不一致。同種樣品顆粒在不同轉(zhuǎn)頭中沉降速度的變化過程是復(fù)雜的。轉(zhuǎn)頭對不同密度、直徑尺寸的顆粒沉降效能的差異是客觀存在的。這使得離心管內(nèi)組成、密度和體積大小不同的樣品組分，當(dāng)所承受的離心力強(qiáng)度與各自沉降所需離心力匹配時(shí)，將不可避免地與實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)樣品組分發(fā)生共沉淀。
       公式(5)還表明：轉(zhuǎn)頭的Rmax與Rmin值之間的差距大，則管內(nèi)RCFmin – RCFmax間跨度大，離心管內(nèi)發(fā)生共沉降的組分越復(fù)雜；轉(zhuǎn)頭Rmax與Rmin值差距越小，內(nèi)部RCFmin – RCFmax跨度越小，轉(zhuǎn)頭沉淀組分則越“單純”。

       研究表明，在相同RCF、離心時(shí)間設(shè)置條件下進(jìn)行的細(xì)胞外囊泡沉降實(shí)驗(yàn)所生成的沉淀物中，不同轉(zhuǎn)頭所沉降的的囊泡大小尺寸覆蓋范圍不同。SW 40 Ti和SW 28兩個(gè)水平轉(zhuǎn)頭的Rmax與Rmin差距大，同等離心設(shè)置下，沉淀物中囊泡的大小尺寸從25 – 300nm不等，構(gòu)成復(fù)雜。而TLA-110轉(zhuǎn)頭沉淀中囊泡大小尺寸構(gòu)成相對簡單，主要以50-100nm直徑的小囊泡為主。因此，而Rmax與Rmin差距的大小一定程度上，可視作樣品沉淀組分純凈度的指示器。

       在外泌體分離實(shí)驗(yàn)中，若要擴(kuò)大囊泡尺寸覆蓋范圍，宜采用Rmax/Rmin比值較大的水平轉(zhuǎn)頭。而要縮窄囊泡尺寸覆蓋范圍，特別是想重點(diǎn)關(guān)注和提高100nm直徑以下的外泌體分離純度，則垂直轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭和傾角更小的角轉(zhuǎn)頭比使用水平轉(zhuǎn)頭會更有效。

1.2 轉(zhuǎn)頭類型差異決定著樣品組分遷移路徑的不同

        要實(shí)現(xiàn)所有組分顆粒的完全沉淀和完整回收，須等管口內(nèi)側(cè)樣品顆粒遷移到管底才行。不同轉(zhuǎn)頭，樣品離心過程中沉降遷移路徑和路線長度不同。
       首先，轉(zhuǎn)頭單管的容量不同，通常適用離心管的管內(nèi)徑、工作長度不同。管容量大，管長度長，樣品沉降路徑長，有效離心時(shí)間相應(yīng)更長。
       其次，對比水平轉(zhuǎn)頭和角轉(zhuǎn)頭可見，管口處樣品顆粒沉降的路徑方向不同：水平轉(zhuǎn)頭內(nèi)樣品遷移沉降方向始終水平指向管底。而角轉(zhuǎn)頭中樣品顆粒先是在離心力作用下水平遷移沉降，觸壁后在管壁處聚集成成更大的顆粒，隨著顆粒繼續(xù)增大和離心力沿管壁方向分力的推動(dòng)下，克服管壁摩擦阻力和溶液阻力沿著管壁下沉，直至最大離心半徑處形成致密沉淀。
       不同轉(zhuǎn)頭、不同工作容量離心管中，樣品沉降路徑的差異，造成樣品沉降時(shí)間存在區(qū)別。通常認(rèn)為，垂直轉(zhuǎn)頭和近垂直轉(zhuǎn)頭沉降時(shí)間較短，而角轉(zhuǎn)頭次之，水平轉(zhuǎn)頭沉降路線最長，速度最慢，用時(shí)最長。
       有效離心時(shí)間的差異，一定程度上影響到各種轉(zhuǎn)頭對樣品組分的離心產(chǎn)量。原因在于，離心管的前半段溶液中RCF強(qiáng)度較低區(qū)域，部分樣品組分因沉降速度較低，無法在設(shè)定時(shí)間內(nèi) “歸隊(duì)”而造成損失，降低了轉(zhuǎn)頭的樣品回收率。特別是外泌體沉淀重懸清洗去除蛋白污染組分步驟，采用樣品回收率更夠高的微量角轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭，可提高外泌體，特別是小直徑外泌體囊泡的回收率、減少損失。 

2、轉(zhuǎn)頭工作容量對離心效能的影響

       轉(zhuǎn)頭工作容量影響樣品分離效能是因兩方面原因造成的。

       2.1 轉(zhuǎn)頭本身幾何結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)因素

表5  100000×g RCF設(shè)定條件下轉(zhuǎn)頭容量與離心效能參數(shù)列表

       表5中的RCFmin代表在100000×g RCF設(shè)定下，轉(zhuǎn)頭最小離心半徑處對應(yīng)RCF。

       數(shù)據(jù)顯示，無論是角轉(zhuǎn)頭還是甩平轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)頭單管容量從4mL增至39mL，轉(zhuǎn)頭Rmin變短的同時(shí)樣品沉降距離變長，RCFmin降低和轉(zhuǎn)頭K因子值增大。RCFmin下降和樣品沉降距離加長，使得有效離心時(shí)間要相應(yīng)延長。否則，樣品回收率要降低。

       在外泌體分離實(shí)驗(yàn)中排空培養(yǎng)基自帶外泌體的環(huán)節(jié)，培養(yǎng)基體積大，所用轉(zhuǎn)頭單管容量（50-100ml）、轉(zhuǎn)頭整體樣品容量也大，外泌體排空的離心時(shí)間越長。大量應(yīng)用實(shí)例中，這一過程的離心時(shí)間長達(dá)15-18小時(shí)。而到外泌體沉淀階段，樣品體積不過2mL，相同RCF和溫度設(shè)置，只需70min-2小時(shí)即可完成。因此，離心機(jī)條件許可情況下，優(yōu)化培養(yǎng)基外泌體排空轉(zhuǎn)頭的選擇，有利于提高效率和實(shí)驗(yàn)流程優(yōu)化。

2.2 離心管樣品裝載體積的影響

       同一超速離心轉(zhuǎn)頭適用的多種不同額定容量圓底離心管，當(dāng)管徑一致時(shí)，則容量差異源于管長度的不同。將樣品管載入轉(zhuǎn)頭時(shí)，通過添加相應(yīng)管帽適配器，既為管頂部提供安全支撐，又確保離心管與離心孔底部的緊貼。

       以Optima MAX-XP臺式超速離心機(jī)的MLA-55角轉(zhuǎn)頭（55000rpm/8×13.5mL）為例。它可使用容量范圍、管徑、長度、材質(zhì)和款式不同的多款超速離心管，包括：

       13.5mL超凈圓頂熱封管（344322，φ16×76 mm）

       13.5mL薄壁超凈開口管（344085，φ16×76 mm）；

       10mL厚壁透明開口管（355630，φ16×76 mm）；

       10.4mL帶蓋透明離心瓶（355603，φ16×76 mm）；

       10mL鐘頂熱封管（344622，φ16×67mm）；

       8.9mL指封管（361623，φ16×60mm）；

       6.3mL g-Max快封管（345830，φ16×44 mm）

       4.2mL g-Max熱封管（356562，φ16×38 mm）；

       6.5mL薄壁超凈開口管（344088，φ13×64 mm）

       4mL厚壁透明開口管（355645，φ13×64 mm）；

       2mL薄壁超凈開口管（344091，φ8×49 mm）。

       其中，6.5mL薄壁超凈開口管、4mL厚壁透明開口管和2mL薄壁超凈開口管三種管徑小于轉(zhuǎn)頭額定16mm直徑標(biāo)準(zhǔn)，使用中須在管外加配管套適配器。單管套適配器的添加，使離心管中心整體上向內(nèi)、向上偏移后，遠(yuǎn)離了轉(zhuǎn)頭最大離心半徑（R_max）位置和最強(qiáng)RCF區(qū)域，造成樣品整體RCF降低，離心效能下降。

       而6.3mL g-Max快封管、4.2mL g-Max熱封管則不同。其管身外徑與標(biāo)準(zhǔn)13.5mL管一致，使用時(shí)無需添加管套適配器。在管帽安裝到位后，離心管底部始終緊貼離心孔的外壁和底部，管身整體上處于轉(zhuǎn)頭RCF最大區(qū)域。其樣品分離效能自然高于使用管套適配器的離心管。此外，其管身短，樣品組分沉降路徑長度短，離心時(shí)間短。因此，g-Max管分離效能高于8.9 – 13.5mL標(biāo)準(zhǔn)尺寸和容量的離心管，實(shí)現(xiàn)少量樣品在高轉(zhuǎn)速、高K因子值而容量較大的轉(zhuǎn)頭中離心，充分利用優(yōu)勢資源，并極大提高離心效能。

       同理，容量相同時(shí)，厚壁開口管離心效能不及薄壁開口管和g-max管的工作成效。

       Beckman轉(zhuǎn)頭“大魚吃小魚”式設(shè)計(jì)優(yōu)勢在于，當(dāng)無法獲得參考文獻(xiàn)中所使用的同款轉(zhuǎn)頭時(shí)，通過用速度較高、容量較大的轉(zhuǎn)頭配合小容量離心管使用，并優(yōu)化RCF設(shè)置和離心時(shí)間設(shè)置，同樣能獲得理想的樣品分離效果。

3、轉(zhuǎn)頭固定傾角大小與轉(zhuǎn)頭離心效能的關(guān)系

       固定傾角大小影響的是角轉(zhuǎn)頭和近垂直轉(zhuǎn)頭的分離效能。

       沉降離心時(shí)間的計(jì)算公式為：

Ts = (1/S)×2.54×10¹¹×1/N²×ln(R_max/R_min)  ···················································· (6)

       式中S代表特定樣品組分在特定溫度、溶液條件下的沉降系數(shù)。N為工作轉(zhuǎn)速。當(dāng)轉(zhuǎn)頭Rav相同或接近時(shí)，離心時(shí)間長短與R_max/R_min比值之自然對數(shù)值正相關(guān)。轉(zhuǎn)頭的傾角大，則R_max/R_min，Ts相應(yīng)也大。

       此外，相同離心管安裝于大傾角轉(zhuǎn)頭中時(shí)，離心管整體向轉(zhuǎn)軸方向傾斜，管的上半部整體RCF小于傾角較小轉(zhuǎn)頭且樣品水平沉降距離增大。故相同離心時(shí)間內(nèi)，大傾角轉(zhuǎn)頭的離心效能低。

4、轉(zhuǎn)頭K因子值的基本概念與運(yùn)用

       轉(zhuǎn)頭K因子（k-factor）又稱k 系數(shù)，是業(yè)內(nèi)為表征轉(zhuǎn)頭離心效能人為賦予的參數(shù)。它源于人們對樣品在特定轉(zhuǎn)頭中最短離心時(shí)間的計(jì)算過程。

       對于特定轉(zhuǎn)頭，R_max/R_min比值是固定的。當(dāng)轉(zhuǎn)速N取轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速時(shí)，則2.54×10¹¹×1/N²×ln(R_max/R_min)為一常數(shù)，人們將這一常數(shù)規(guī)定為k因子，即：

K = 2.54×10¹¹×1/N²×ln(R_max/R_min)   ···················································· (7)

       公式(7)表明：轉(zhuǎn)頭k因子值與工作轉(zhuǎn)速、R_max/R_min有關(guān)。無論是因工作轉(zhuǎn)速Neff降低或因轉(zhuǎn)頭R_max/R_min比值上升，均造成轉(zhuǎn)頭離心效能下降同時(shí)K因子值增大。而k因子值降低則宣示了轉(zhuǎn)頭離心效能提高。

       若規(guī)定K_eff代表工作轉(zhuǎn)速Neff時(shí)的k因子值，K為轉(zhuǎn)頭最高轉(zhuǎn)速N時(shí)k因子值，可得到k_eff 、K間換算公式：

k_eff = K×N/N_eff    ···················································· (8)

       這表明：轉(zhuǎn)頭工作轉(zhuǎn)速高則k值低，轉(zhuǎn)速降低則k值升高。

       對于特定型號轉(zhuǎn)頭，ln(R_max/R_min)是固定的，因此，確定了工作轉(zhuǎn)速，就相當(dāng)于確定了k_eff值。

       而根據(jù)轉(zhuǎn)頭的k因子值，即可評估轉(zhuǎn)頭離心效能高低（見表6）。 

表6 100000×g RCF值條件下超速離心轉(zhuǎn)頭工作參數(shù)

       數(shù)據(jù)顯示，相同樣品條件和相同100000×g RCF設(shè)置下，分離效能最佳的前5個(gè)轉(zhuǎn)頭為清一色Optima MAX-XP臺式超速離心機(jī)適用轉(zhuǎn)頭，從高到低分別是：

       TLA-120.2（12×2.0mL）

       TLA-100.3（6×3.5mL）

       MLA-130（10×2.0mL）

       TLA-110（8×5.1mL）

       MLA-80（8×8.0mL）

5、根據(jù)轉(zhuǎn)頭工作效能確定外泌體超速離心分離的解決方案

       離心機(jī)驅(qū)動(dòng)控制系統(tǒng)是以轉(zhuǎn)頭平均半徑（Rav）作為有效離心半徑，采用公式(5)的原理自動(dòng)計(jì)算特定轉(zhuǎn)速的RCF值，或依據(jù)實(shí)驗(yàn)者設(shè)定的RCF值計(jì)算并控制轉(zhuǎn)頭工作轉(zhuǎn)速的。轉(zhuǎn)頭的分離效能，受離心半徑、傾角大小、樣品容量和離心管的選擇等多重因素制約。僅僅關(guān)注FCR設(shè)置值大小，不足以有效、全面評估轉(zhuǎn)頭的離心效果。
       就外泌體分離實(shí)驗(yàn)而言，轉(zhuǎn)頭選型方案對外泌體的提取產(chǎn)量、品質(zhì)和離心時(shí)間長短都有直接影響。在轉(zhuǎn)頭的選擇和特定轉(zhuǎn)頭工作參數(shù)的優(yōu)化調(diào)整上，可參考以下原則：
5.1 根據(jù)研究側(cè)重點(diǎn)選擇最適宜的轉(zhuǎn)頭
       當(dāng)研究目標(biāo)為整個(gè)細(xì)胞外囊泡群的構(gòu)成及動(dòng)態(tài)變化規(guī)律時(shí)，采用Rman/Rmin比值較大的水平轉(zhuǎn)頭或大角度角轉(zhuǎn)頭較為有利。當(dāng)研究主要對象為中小直徑囊泡時(shí)，則Rman/Rmin比值較小的垂直轉(zhuǎn)頭、近垂直轉(zhuǎn)頭及傾角相對較小的角轉(zhuǎn)頭是首選。
       要縮短外泌體離心操作流程所需時(shí)間，Rman/Rmin小比值類轉(zhuǎn)頭無疑較為理想。
       而針對外泌體密度梯度純化分離，在時(shí)間條件允許時(shí)，單管容量3.5 – 13.5mL的水平轉(zhuǎn)頭或角轉(zhuǎn)頭都可以考慮。

5.2 根據(jù)自身轉(zhuǎn)頭條件優(yōu)化調(diào)整離心參數(shù)
       外泌體超速分離中， RCF值設(shè)定明確后，為確保溶液中樣品回收率和離心效率，對Rmin小的轉(zhuǎn)頭宜適度延長離心時(shí)間。同理，若采用相同離心時(shí)間設(shè)置，可優(yōu)先嘗試將Rmin較小轉(zhuǎn)頭的RCFmin適度提高，達(dá)到兩種轉(zhuǎn)頭的RCFmin值接近的效果?；蛘咭雊-max管，確保樣品的RCF環(huán)境趨于接近。
       以單管容量均為39mL的MLA-50與Type 70 Ti兩個(gè)轉(zhuǎn)頭為例：Type 70 Ti的Rmin和RCFmin大、K因子值小，故分離效能高于MLA-50。如參考方案是Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭100000×g下離心70分鐘設(shè)置，則多半采用了快速升降速模式設(shè)置。要用MLA-50轉(zhuǎn)頭來替代，則離心時(shí)間應(yīng)適度延長。反之，若參考方案為MLA-50轉(zhuǎn)頭，而須用Type 70 Ti轉(zhuǎn)頭進(jìn)行，則延長離心時(shí)間不必延長。

 （后續(xù)：Optima MAX-XP臺式超速離心機(jī)在外泌體分離操作中時(shí)間的設(shè)定）