Beckman二戰(zhàn)后到上世紀(jì)80年代，大批有影響力的超速離心技術(shù)理論專著出版發(fā)行。如1959 年，生物化學(xué)家 Howard K. Schachman教科書式著述《生物化學(xué)中的超速離心》出版。1962 年，Hiroshi Fujita用《沉降分析數(shù)學(xué)理論》系統(tǒng)闡述了超速離心實驗中擴(kuò)散綜合效應(yīng)、溶質(zhì)沉降系數(shù)濃度依賴性和沉降邊界形狀的數(shù)學(xué)理論，隨后1975 年他的《超速離心分析基礎(chǔ)》一書問世。此外， Steensgaard. J 等的《生物化學(xué)的方法學(xué)發(fā)展》，C.A. Price 的《密度梯度離心》和B.D. Hames的《密度梯度離心條件的選擇》等著述涌現(xiàn)，可視為超離技術(shù)理論體系構(gòu)建完成并日臻完善的標(biāo)志。

        同時，超速離心方法的開發(fā)應(yīng)用也取得了長足進(jìn)步。1951年Myro Kendall Brake提出了速度-區(qū)帶密度離心方法（rate-zonal centrifugation）。1959年，Matthew Meselson和Christian de Duve等成功開發(fā)等密度梯度離心法（Isopyonic centrifugation）。Matthew Meselson還與 Franklin Stahl使用高濃度CsCl溶液超速離心實驗中成功分離DNA樣品。超速離心理論的引領(lǐng)和新方法的應(yīng)用，推動生命科學(xué)研究領(lǐng)域里程碑式重大發(fā)現(xiàn)的井噴。借助超速離心技術(shù)，業(yè)界陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了線粒體和核糖體（蔗糖密度梯度離心法）和溶酶體等細(xì)胞器，建立了噬菌體遺傳物質(zhì)是DNA、 DNA半保留復(fù)制和DNA復(fù)制中的岡崎片段等關(guān)鍵基礎(chǔ)理論。
       當(dāng)超速離心機(jī)的定角轉(zhuǎn)頭和水平轉(zhuǎn)頭已成功應(yīng)用近半個世紀(jì)后，近垂直轉(zhuǎn)頭（Near-Vertical Rotor, NVT)終于在1989年姍姍來遲。比起甩平轉(zhuǎn)頭已沉淀的海量應(yīng)用底蘊，錯失科學(xué)大發(fā)現(xiàn)風(fēng)口的NVT轉(zhuǎn)頭，是實實在在的“輸在起跑線上”。
       超離用的NVT轉(zhuǎn)頭有何獨特性能優(yōu)勢，Beckman等超離巨頭推出NVT初衷是什么，而NVT對使用者而言到底有何特殊價值？這些問題正是本文嘗試探討的主題。
       NVT近垂直轉(zhuǎn)頭是充分融合定角轉(zhuǎn)頭（20°- 45°）和垂直轉(zhuǎn)頭（Vertical Rotor, VT）兩二者屬性特點而開發(fā)的一種較新型轉(zhuǎn)頭。從剖面上看，轉(zhuǎn)頭的離心孔、轉(zhuǎn)軸的中線間有一7.5°– 8.5°的夾角，本質(zhì)上它屬于定角轉(zhuǎn)頭。但其角度明顯小于定角轉(zhuǎn)頭的20° - 45°角，而與垂直轉(zhuǎn)頭的0°角極近，故命名為近垂直轉(zhuǎn)頭。                                              

      NVT既有垂直轉(zhuǎn)頭樣品容量大、可承受的梯度介質(zhì)密度高（可達(dá)1.7g/ml）、轉(zhuǎn)速高（Optima XE-100、Optima XPN-100系列超速離心機(jī)近垂直轉(zhuǎn)頭NVT100可承受100000rpm）、樣品沉降路徑短、分離速度快（離心時間比垂直轉(zhuǎn)頭稍長，但比定角轉(zhuǎn)頭、甩平轉(zhuǎn)頭都短）的優(yōu)勢，又因有固定傾角，被沉淀組分可沿離心管外側(cè)管壁滑向管底部并沉積成團(tuán)（pelleting）。特定組分通過沉淀與其它可溶性成份分離后，收集沉淀十分方便。而在質(zhì)粒純化肘，NVT轉(zhuǎn)頭可將RNA在梯度介質(zhì)下層管底形成沉淀，避免RNA了與質(zhì)粒DNA樣品帶接觸，防止污染。
       理論上，NVT轉(zhuǎn)頭可用于膜蛋白質(zhì)等生物大分子和細(xì)胞器的差速離心（Differential centrifugation）沉淀、速度-區(qū)帶離心（Rate zonal centrifugation），還可承擔(dān)平衡密度梯度離心（equilibrium density gradient centrifugation）或等密度離心（Isopycnic centrifugation）任務(wù)。
       阿拉斯加科技（北京）有限公司應(yīng)用支持小組，在2023年6月份，組織實施了一項對Beckman超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭在科研實驗中應(yīng)用情況的分類調(diào)研計劃。調(diào)研的結(jié)果從本篇開始陸續(xù)刊載。

1、Beckman NVT轉(zhuǎn)頭在生物樣品超速離心的實際使用概況

       調(diào)研對象：Beckman NVT 100、NVT 90、NVT 65和NVT 65.2四個近垂直轉(zhuǎn)頭

       調(diào)研內(nèi)容：NVT離心分離的具體對象和使用方法

       資料來源：截止至2023.06.30 PubMed期刊在線數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）已收錄的、使用了上述四個轉(zhuǎn)頭中任何一個進(jìn)行樣品超速離心處理的公開實驗論文。

表1.  Beckman NVT系列轉(zhuǎn)頭文獻(xiàn)使用頻次統(tǒng)計

       表1顯示，Beckman超速離心機(jī)配套的4個近垂直轉(zhuǎn)頭中，論文中出現(xiàn)次數(shù)最多的是NVT 65和NVT 90。

       根據(jù)SCI期刊影響因子查詢網(wǎng)站（http://sci.justscience.cn）各期刊2023年的IFoid分值數(shù)據(jù)，先剔除無IFoid分值或分值≤4.000的刊文；再將文中轉(zhuǎn)頭信息明顯有誤的記錄舍棄，最后把屬于同一研究小組發(fā)表在不同年份不同、但超離部分實驗采用完全相同離心參數(shù)條件的多篇論文視作1篇統(tǒng)計處理后，剩余79篇刊文。

       逐篇文章梳理復(fù)核后，按離心實驗樣品的類型逐一歸類統(tǒng)計，結(jié)果見下圖1。

       統(tǒng)計結(jié)果顯示，近垂直轉(zhuǎn)頭適用的對象涵蓋了蛋白、核酸、病毒、細(xì)胞器和脂肪酸等五大類生物組分。NVT的應(yīng)用案例有限，卻亮點紛呈。

1.1 病毒類樣品分離

       Beckman NVT系列超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭用于病毒類樣品分離純化主要是三個用途。一是從轉(zhuǎn)染了重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adeno-associated virus vectors, rAAV vectors)的細(xì)胞中分離載體病毒，評估驗證病毒表達(dá)和滴度。二是將外源靶基因整合于病毒載體經(jīng)細(xì)胞表達(dá)后制備收集疫苗類蛋白。三是構(gòu)建病毒特定編碼基因的突變體，分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物，以了解病毒結(jié)構(gòu)蛋白或特定功能蛋白復(fù)合體的組裝機(jī)制。

       資料顯示，與NVT轉(zhuǎn)頭有關(guān)的病毒類應(yīng)用中，報道最多的(rAAV vector，其次是噬菌體(phage)和病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs)。

       CRISPR/Cas9是目前基因組編輯操作最流行的工具。而腺病毒相關(guān)載體以其體內(nèi)低免疫原性、非致病性、穩(wěn)定長效表達(dá)和一定程度的組織選擇性，被視為最有前景的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。由此吸引了人們將CRISPR-Cas9與AAVs一起部署開發(fā)新型AAV-CRISPR-Cas9載體平臺，以期安全有效地用于基因組編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和拓展改進(jìn)rAAV的應(yīng)用。哈佛大學(xué)研究人員對修飾小鼠遺傳缺陷的治療工具載體AAV-Cas9-gRNA的病毒生物分布、各種器官的編輯效率、抗原性、免疫反應(yīng)和生理反應(yīng)等進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，AAV-Cas9-gRNA在小鼠體內(nèi)可有效激活宿主免疫，未出現(xiàn)其它載體工具中常見的細(xì)胞損傷現(xiàn)象。對rAAV載體的純化，使用了Optiprep（主要成分是碘克沙醇o(jì)dixanol）密度梯度介質(zhì)的離心方法。將含AAV的細(xì)胞裂解上清液，經(jīng)50 kDa MWCO超濾和濃縮處理，加載到由15%，25%，40%，60%各2ml組成的不連續(xù)密度梯度液頂部。使用NVT65轉(zhuǎn)子58000rpm、18℃離心1.5小時后，收集位于40% - 60%梯度界面處的AAV條帶進(jìn)行下一步分析測定。

       噬菌體（Bacteriophage）是一種專門感染細(xì)菌、真菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒，分為毒性噬菌體（virulent phage）和溫和噬菌體（temperate phage）兩類。

       毒性噬菌體感染宿主后，會利用細(xì)菌胞體內(nèi)的原料合成核酸和蛋白質(zhì)裝配成成熟的子代噬菌體，并最終裂解宿主菌體，釋放出子代噬菌體繼續(xù)下一步感染。溫合噬菌體感染細(xì)菌，只將自身基因整合到細(xì)菌染色體上（自身其余結(jié)構(gòu)組件溶解），但不引起細(xì)菌裂解。這種整合在細(xì)菌基因組上的外來噬菌體基因稱為原噬菌體/前噬菌體（prophage）。原噬菌體可隨細(xì)菌染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)菌的分裂將原噬菌體傳給下一代細(xì)菌。當(dāng)有低劑量紫外線照射，或其他物理、化學(xué)方法等誘導(dǎo)因素作用時，前噬菌體可被激活，自我復(fù)制并產(chǎn)生大量新的成熟噬菌體，裂解宿主胞體并釋放出噬菌體粒子。溫和噬菌體這種產(chǎn)生成熟噬菌體和溶解宿主菌的潛力，稱為溶原性( lysogeny)。

       在漫長的進(jìn)化機(jī)制驅(qū)動下，細(xì)菌與噬菌體間演變?yōu)橐欢ǔ潭鹊南嗌嗫?、互利互惠關(guān)系。一方面細(xì)菌通過CRISPR-Cas系統(tǒng)機(jī)制對抗毒性噬菌體感染。另一方面，細(xì)菌明修棧道暗度陳倉，在受輔助噬菌體（屬溫活噬菌體）感染后，細(xì)菌蛋白編碼基因激活，與噬菌體的支架蛋白（scaffolding protein, SP) 競爭衣殼蛋白 (capsid protein, CP) 結(jié)合位點而改裝噬菌體衣殼蛋白內(nèi)部空間構(gòu)象。改裝后的噬菌體衣殼蛋白，無法容納噬菌體整個基因組，只能進(jìn)行細(xì)菌特定基因片段的包裝。借此貍貓換太子的神操作，宿主菌利用輔助噬菌體的病毒組裝機(jī)制產(chǎn)生大量具有感染活性的假噬菌體顆粒。最終，隨著宿主菌體裂解，攜帶有宿主菌基因的假噬菌體釋放并感染新宿主菌，細(xì)菌特定基因得以在菌體群落中保留與潛行。

       金黃色葡萄球菌的大多數(shù)毒力因子編碼在前噬菌體、質(zhì)粒和基因組島等可移動基因元件（mobilegenetic elements，MGEs）上。金黃色葡萄球菌致病島(Staphylococcus aureus pathogenic island，SaPI)是一個編碼包括毒素、粘附素、凝血因子和免疫調(diào)節(jié)因子等一系列毒力因子的龐大基因組島家族，屬典型的噬菌體誘導(dǎo)性染色體島(Phage-Inducible Chromosomal Islands，PICIs)。在無輔助噬菌體感染時，SaPI表達(dá)被抑制子抑制而處于前噬菌體狀態(tài)。在輔助噬菌體感染并處于溶菌周期時，噬菌體表達(dá)一種去阻遏蛋白幫助SaPI從宿主染色體上切除、復(fù)制并表達(dá)。其表達(dá)產(chǎn)物可通過調(diào)節(jié)輔助噬菌體衣殼的裝配，使SaPI基因被優(yōu)先包裝防止形成成熟的噬菌體顆粒。噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的MGEs水平轉(zhuǎn)移( horizontal gene transfer)導(dǎo)致新的毒素基因產(chǎn)生、不同菌株基因組間的差異以及高致病性菌株的產(chǎn)生，在細(xì)菌基因組進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境壓力中發(fā)揮重要作用，引起了學(xué)界廣泛關(guān)注。

       溫合噬菌體80α是感染金黃色葡萄球菌和其他革蘭氏陽性細(xì)菌的輔助噬菌體的代表，是包括SaPI1，SaPI2和SaPIbov1在內(nèi)多種SaPI移動遺傳元件高頻動員的輔助者。80α具有直徑為63 nm的T = 7二十面體衣殼和190 nm長的彎曲尾部。80α衣殼蛋白（CP，324個殘基）首先組裝成一個空的前衣殼（procapsid），需支架蛋白（SP，206個殘基）作為組裝伴侶。SaPI1通過編碼的CpmB蛋白，與80α衣殼蛋白結(jié)合，將噬菌體80α衣殼打造成了SaPI1基因組的私人定制包裝。

       美國國立衛(wèi)生研究院國家關(guān)節(jié)炎-肌肉骨骼和皮膚病研究所的研究小組采用了2-3步超速離心的方法分離純化2株金黃色葡萄球菌的蛋白組分，用于Western Blot檢測和前衣殼蛋白的電子顯微鏡結(jié)構(gòu)分析。實驗中蛋白樣品制備流程簡述如下：

       1）用絲裂霉素誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌80α溶原菌株誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生噬菌體80α前衣殼procapsids；

       2）裂解菌體后，7000g離心20 min去除菌體碎片；

       3）上清中可溶性蛋白，用10% PEG 8000（w / v）和0.5M NaCl重懸后，7000g離心20分鐘，收集沉淀；

       4）將沉淀重懸于噬菌體緩沖液中，上樣覆蓋于濃度1.42 g/cm3的CsCl溶液層上，用Beckman NVT90轉(zhuǎn)子15℃ 70000rpm離心20小時。 用針頭收集含有前衣殼的條帶，用噬菌體透析緩沖液（25 mM Tris-HCl pH 7.8，50 mM NaCl，1 mM MgSO4和4 mM CaCl 2）透析處理除去樣品中的CsCl；

       5）初步純化的噬菌體蛋白組分在10–40%（w / v）蔗糖連續(xù)梯度液中用SW41轉(zhuǎn)子4℃ 30000rpm離心2小時，將前衣殼與噬菌體尾巴分離。收集純化后的前衣殼條，一部分用于SDS-PAGE實驗鑒定，其余部分用于下一步的操作；

       6）經(jīng)蔗糖梯度純化后的樣品用透析緩沖液稀釋后，在70Ti轉(zhuǎn)子中50000rpm 4℃下1小時離心后，將沉淀重懸于噬菌體透析緩沖液中。制備衣殼蛋白的電子顯微鏡分析樣品。

       病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs)具有與病毒顆粒類似的結(jié)構(gòu)，但不含復(fù)制酶和編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白的核酸，缺乏復(fù)制能力。大腸桿菌、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和植物等多種表達(dá)體系可表達(dá)VLPs。諾瓦克病毒（Norwalk virus, NV）是一種可造成人類急性胃腸炎流行性暴發(fā)的單鏈RNA病毒。其衣殼由主要結(jié)構(gòu)蛋白的多個拷貝構(gòu)成，決定著病毒結(jié)構(gòu)完整性、免疫原性和感染性。衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)后可自組裝產(chǎn)生在形態(tài)和抗原上與天然NV顆粒十分相似的NV病毒樣顆粒。

       為鑒定參與組裝NV衣殼蛋白功能結(jié)構(gòu)域，研究人員構(gòu)建了10個衣殼蛋白的缺失突變體用VLP作為載體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。將細(xì)胞裂解液添加至30%初始濃度的碘克沙醇溶液頂部，通過離心形成自生成等滲密度梯度，用NVT-65.2轉(zhuǎn)子中63000rpm離心3小時后，收集蛋白條帶，經(jīng)進(jìn)一步純化后用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的可溶性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析和Western Blot檢測。

1.2 質(zhì)粒/核酸純化

       Beckman 超速離心機(jī)NVT系列轉(zhuǎn)頭用于核酸分離純化應(yīng)用的報道，除了常規(guī)組織/細(xì)胞/微生物DNA(如HSP90基因、線粒體DNA（mtDNA)、工程菌體質(zhì)粒DNA純化（如pUC：HSP90rr環(huán)狀質(zhì)粒）和RNA/Poly(A+) RNA分離外，還有環(huán)境微生物研究中關(guān)于DNA穩(wěn)定同位素核酸探針檢測(Stable isotope probing of DNA, 13C-DNA-SIP)、RNA穩(wěn)定同位素探針檢測 （Stable isotope probing of RNA, RNA -SIP）等應(yīng)用。

（待續(xù)：試析近垂直轉(zhuǎn)子在超速離心中的應(yīng)用-中）