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產(chǎn)品課堂

什么是熒光顯微鏡中的光漂白及減少光漂白的方法

光致漂白是熒光團(tuán)由于光引起的破壞而失去熒光的現(xiàn)象。這導(dǎo)致在對樣品成像時熒光和信號的損失。

人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的熒光顯微圖

當(dāng)適當(dāng)波長的光入射到熒光團(tuán)上時,它會從基態(tài)躍遷到激發(fā)的單重態(tài)和三重態(tài)階段。在其激發(fā)態(tài)下,它可能與其他分子相互作用并經(jīng)歷永久性共價修飾。

而且,與單重態(tài)相比,三重態(tài)的壽命更長,這使其更易于與其他分子相互作用。每個熒光分子在激發(fā)和發(fā)射之間的這些循環(huán)總數(shù)取決于其結(jié)構(gòu)和周圍的局部環(huán)境。 

基于這些參數(shù),某些熒光團(tuán)可以快速漂白,而另一些熒光團(tuán)可以在漂白之前經(jīng)歷數(shù)千次激發(fā)和發(fā)射循環(huán)。

減少光漂白的方法

降低光強度

降低光的強度可以減少熒光團(tuán)對光的暴露,從而減少其經(jīng)歷的激發(fā)發(fā)射循環(huán)。這最終減少了與其相關(guān)的光致漂白。但是,降低光強度也會降低信號強度。因此,應(yīng)在實現(xiàn)正確的信號強度和最小化光漂白之間取得正確的平衡。

減少曝光時間

這是降低光漂白效果的另一種方法。在這種情況下,減少曝光時間將減少熒光團(tuán)經(jīng)歷激發(fā)-發(fā)射循環(huán)的次數(shù),從而減少光致漂白。這可以通過減少激光的像素停留時間或固定更快的成像幀/秒速率來實現(xiàn)。

另一種方法是限制成像區(qū)域。這可以通過固定一個較小的目標(biāo)區(qū)域并在對該區(qū)域成像后繼續(xù)移動到相鄰區(qū)域來實現(xiàn)。

添加防褪色劑

防褪色劑是可以降低光漂白效果的試劑。這些是封固劑,在免疫組化的所有步驟之后,在成像前的最后一步中使用。

使用其他染料

不同的染料或熒光團(tuán)具有不同的光漂白性能。例如,與綠色熒光蛋白相比,紅色熒光蛋白更容易發(fā)生光漂白。因此,改變選擇的染料并使用一種更耐光的染料也可以用來減少樣品的光漂白。

使用中性密度濾鏡

使用中性密度濾光片還可以減少入射到樣品上的光或光子數(shù)。這也可以減少樣品對光的暴露并減少光致漂白。同樣,這也可以降低樣品的信號。

解決此問題的一種方法是增加光電倍增器的增益功能。但是,增加此功能也會增加噪聲以及圖像信號。因此,應(yīng)在信噪比和光漂白之間達(dá)到適當(dāng)?shù)钠胶?,以獲得最佳圖像。

光漂白的用途

當(dāng)樣品包含由于內(nèi)源性熒光團(tuán)而自然發(fā)出熒光的細(xì)胞物體時,自發(fā)熒光是一種現(xiàn)象。這些組織或細(xì)胞器通常以與常用熒光團(tuán)相似的波長發(fā)出熒光,例如綠色熒光蛋白(GFP)或異硫氰酸熒光素(FITC)。這增加了在區(qū)分實際信號和來自內(nèi)源熒光團(tuán)的信號時的誤差。在這種情況下,可以將光漂白用作工具。可以將圖像暴露在紫外線下兩個小時,以漂白內(nèi)源性熒光團(tuán),然后用適當(dāng)?shù)墓馓禺愋詿晒獾鞍祝ɡ鏕FP)對樣品進(jìn)行成像,以降低自發(fā)熒光作用。