——淺談防生物污染離心機在實驗室安全管理中的拓展應(yīng)用(三)

《用防生物污染轉(zhuǎn)頭提升離心所致氣溶膠防控能力》文中提到，目前市面有數(shù)十款防生物污染轉(zhuǎn)頭可供生物安全實驗室離心機使用。這些產(chǎn)品的生物安全防護性能驗證標準是什么，測試結(jié)果是否靠譜？本文我們就這個問題進行探討。

一、防生物污染轉(zhuǎn)頭的安全防護性能誰說了算？

生物安全實驗室用防污染轉(zhuǎn)頭，使其在關(guān)鍵環(huán)節(jié)上發(fā)揮應(yīng)有效用，增強實驗室生物安全風險防護能力。這要求轉(zhuǎn)頭實際防護性能的可靠性須足夠硬核才行。

阿拉斯加科技（北京）有限公司對離心機生物安全防護技術(shù)進展的調(diào)查顯示，德國eppendorf，美國Beckman、Thermo等一線離心機制造商的產(chǎn)品彩頁和/或用戶手冊對轉(zhuǎn)頭生物安全防護性能認證都有介紹說明。

以美國賽默飛為例，我們。新型大容量臺式低溫高速離心機Multifuge X4R Pro用戶手冊提供了多款、多批次具有生物安全防護功能轉(zhuǎn)頭的防生物污染性能的驗證文件。如：

2009年英國HPA認證的：2009年TX-750水平轉(zhuǎn)頭(4700rpm)、F13-14x50cy錐形管角轉(zhuǎn)頭(10000rpm)、F15-8x50cy角轉(zhuǎn)頭(14500rpm)、F14-6x250 LE大容量角轉(zhuǎn)頭(11000rpm)、F15-6x100y角轉(zhuǎn)頭(15000rpm)、MicroClick 30x1.5/2mL微量角轉(zhuǎn)頭(15200rpm)、M-20微孔板轉(zhuǎn)頭(40000rpm)等；

2013年驗證HIGHConic II角轉(zhuǎn)頭(10350rpm)；

2014年驗證的MicroClick 18x5mL角轉(zhuǎn)頭(15000rpm)；

2018年驗證的F10-6x100 LEX角轉(zhuǎn)頭(10500rpm)。

圖上可見，驗證文件注明了測試轉(zhuǎn)頭類型、測試轉(zhuǎn)速和測試技術(shù)標準。水平轉(zhuǎn)頭還注明轉(zhuǎn)頭所用吊籃。

Eppendorf公司也用戶手冊中提供各型轉(zhuǎn)頭通過防生物污染測試的文件（如下圖所示）。

上圖可見，驗證文件注明了測試轉(zhuǎn)頭和所屬機型。

美國Beckman的Avanti J26S XPI立式大容量低溫高速離心機的JA-25.50、JA-25.15、JA-20.1、JA-20、JA-17、JA-14、JA-14.50、JA-12、JA-18、JLA-16.250、JLA-10.500、JLA-8.1000共12個角轉(zhuǎn)頭有“Bio-C”標識。代表這部分轉(zhuǎn)頭通過微生物氣溶膠遏制測試獲得 “BioCertified”認證。其測試由獨立第三方實驗室完成，即：英國Porton Down的CAMR或USAMARIID（美國軍隊傳染病醫(yī)學研究中心）下屬Fort Detrick生物實驗室（德特里克堡生物實驗室）。

日本日立公司的落地式大容量低溫高速離心機CR22N則是部分帶Biosafety標識的轉(zhuǎn)頭，如12×10mL角轉(zhuǎn)頭R22A6，取得HPA生物安全防護認證；另一部分轉(zhuǎn)頭，如6×250mL角轉(zhuǎn)頭R13A，則是根據(jù)IEC61010-2-020附錄AA的規(guī)定流程內(nèi)部完成的測試。

日本kubota公司轉(zhuǎn)頭的生物安全防護認證由CAMR提供。

以上資料表明：

知名離心機制造商都選擇了英國HPA（Health Protection Agency）應(yīng)用微生物研究中心（Centre for Applied Microbiological Research，CAMR）作為獨立第三方進行氣密性能認證。

CAMR認證證明至少有3個版本，即2003年前CAMR版（備注：2003年HPA成立），2003-2012年間HPA版和2012年后HPE版（備注：2012年HPA被并入Health Protection England/PHE后，CAMR隸屬于Centre of Emergency Preparedness and Response）。2020年8月18日，為有效應(yīng)對生物武器和新冠病毒疫情等傳染病威脅，英國組建國家衛(wèi)生防護研究所（National Institute for Health Protection/NIHP）替代PHE?？梢灶A見，認證文件版本還得變！

二、離心機轉(zhuǎn)頭生物安全防護性能測試金標準

盡管十幾年間CAMR認證歷經(jīng)獨立品牌授權(quán)、HPA、HPE和可預見的NIHP變更，但不變的是CAMR測試結(jié)果的權(quán)威性和所頒發(fā)Certificate of Containment Testing的含金量。除了CAMR多年來積累的軟硬件體系成就，鑄就其在生物安全認證測試行業(yè)口碑的是其采用的測試標準——IEC 61010-2-020。

IEC 61010-2-020創(chuàng)建于1992年，歷經(jīng)了1996、2006和2016年4次大修訂，目前是2016年第三版。

我國目前使用國標文件《測量、控制和實驗室用電氣設(shè)備的安全性要求.第2-020部分:實驗室離心機特殊要求》(GB 4793.7-2008)，與IEC 61010-2-020:2006對應(yīng)。

通過GB 4793.7-2008，我們依然可以初步了解61010-2-020:2006與IEC 61010-2-020:2016關(guān)于離心機生物安全防護轉(zhuǎn)頭氣密性驗證的核心要求。

三、離心機生物安全防護轉(zhuǎn)頭性能測試測什么，如何測？

國標GB 4793.7-2008《附錄AA 密封圈的動態(tài)微生物試驗方法》，對生物安全驗證測試條件、測試要求、測試步驟和質(zhì)控標準都有詳細描述。了解其內(nèi)容便于理解轉(zhuǎn)頭的氣密性防護的含義。

1. 測試目的：將吊籃或轉(zhuǎn)頭的密封圈暴露在密集的細菌孢子懸浮液上來觀察是否有細菌孢子逸出。

2. 測試準備：

枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢（Bacillus atrophaeus Nakamura或B. globigii)) 水懸浮液，濃度≥1×1010個孢子/mL（備注：評價消毒劑對芽孢消殺效果時懸液濃度通常為106-108 cfu/mL）；

固定角度轉(zhuǎn)頭：將試驗懸浮液裝入受試轉(zhuǎn)頭離心管/瓶內(nèi)，不加蓋或不密封地放置在轉(zhuǎn)頭的每個位置。用吸管另取實驗懸浮液模擬“灑落”轉(zhuǎn)頭中間。1.5-50mL管的轉(zhuǎn)頭“灑落”液體容積≥5 mL，100mL及以上轉(zhuǎn)頭，遺撒體積為單個離心容器容量10%。

吊籃密封方法:直接把吊籃按額定容量裝填懸浮液后加密封鎖緊，緩慢顛倒吊籃兩次，以便試驗液落在吊籃封口處。

3. 實驗方法

吊籃或轉(zhuǎn)頭安裝于指定離心機使用，啟動加速到轉(zhuǎn)頭額定最大轉(zhuǎn)速并保持轉(zhuǎn)速5 min后停機取樣。取樣部位包括：吊籃或密封圈整個外側(cè)表面取樣；離心腔體內(nèi)存表面轉(zhuǎn)頭和吊籃運行高度一周多點取樣；吊籃轉(zhuǎn)頭表面取樣及對可能污染的地方取樣。

4. 判定標準：每個轉(zhuǎn)頭或吊籃進行三次獨立測試，三次測試都合格視為通過測試。

四、離心機防污生物污染轉(zhuǎn)頭驗證的解讀

枯草芽孢桿菌黑色變種菌，為國內(nèi)外通行的滅菌效果評價的指示菌。其芽孢生存能力強，外形更短小，尺寸小至以μm計。

在轉(zhuǎn)頭內(nèi)部發(fā)生大量樣品遺撒、并以額定最高轉(zhuǎn)速運行，高濃度細微芽孢粒子在高達數(shù)千-數(shù)萬xg離心力加持下，防生物污染轉(zhuǎn)頭能把灑落樣品嚴格限制在密封圈內(nèi)，防止孢子滲透進入轉(zhuǎn)頭蓋外圍進而擴散，徹底截斷污染源外溢途徑，杜絕生成氣溶膠的風險。

作為全球通行的標準，到IEC 61010-2-020：2016都尚未建立防生物污染轉(zhuǎn)頭動態(tài)防病毒污染測試規(guī)程，使得對通過防生物污染驗證轉(zhuǎn)頭對病毒實際防護能力一直缺少最直接證據(jù)（可能與各國實驗室生物安全保障政策許可有關(guān)）。病原微生物以特定形式存在于樣品介質(zhì)中，通過阻斷傳輸介質(zhì)擴散即可防控病原微生物本身的擴散。人們可能正是基于這樣的認識，接受了和認同了IEC防生物污染技術(shù)標準的意義。

國家CDC公布COVID-19電鏡圖像資料后，即有微生物學權(quán)威人士指出，當病毒粒子與體液等介質(zhì)結(jié)合后，形成的病毒顆粒尺寸可達到數(shù)μm。如結(jié)論屬實，則枯草芽孢桿菌黑色變種芽孢在一定程度上可視作病毒顆粒的“動作替身”。而眾所周知的是，N95口罩可濾除最小顆粒直徑0.3μm，能濾阻99%以上病毒顆粒和氣溶膠。推測通過嚴格生物安全性能驗證的轉(zhuǎn)頭通過把樣品嚴密密封而有效阻斷高危風險氣溶膠形成和擴散。而數(shù)十年來全球應(yīng)對高危病原微生物的研究實踐也表明，防生物污染轉(zhuǎn)頭是生物安全實驗室離心安全可靠技術(shù)手段。

據(jù)此，《生物安全實驗室離心機必須使用防生物污染達標轉(zhuǎn)頭？》的討論才有立足之地。

參考文獻：

1.《實驗室生物安全手冊》(第三版/2004)

2. 《中華人名共和國國家標準》（GB4793.7-20008/IEC61010-2-020:2006）

3. Thermo Scientific Multifuge X Pro/Megafuge ST Plus Series Centrifuges Instructions for Use(50158487-d；08/2019)

4. Centrifuge 5804 5804R 5810 5810R操作手冊(5820900067-01/012018)